謝強，苗淑萍，史守紀(jì)，陳金標(biāo)，夏秀華（無錫商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇無錫214153）

隨著科技的迅猛發(fā)展，食品工業(yè)產(chǎn)值增長以其遠遠超過GDP的增長速度快速增長。然而，食品工業(yè)的發(fā)展離不開食品防腐劑的保駕護航。市場上使用的食品防腐劑主要分為化學(xué)合成與天然提取物兩大類。目前，化學(xué)防腐劑在應(yīng)用中依然占據(jù)統(tǒng)治地位，這與人們?nèi)找嬖鲩L的食品安全意識與綠色飲食觀念形成矛盾。于是，從自然界開發(fā)獲得天然食品防腐劑成為科學(xué)工作者關(guān)注的熱點，也是今后防腐劑發(fā)展的主要方向。天然食品防腐劑根據(jù)來源不同可分為植物源、微生物源和動物源3大類。天然植物以其豐富的資源和高效低毒的特性，在食品行業(yè)中的研究和應(yīng)用越來越廣泛。食用香辛料自然成為備受關(guān)注的一類，目前研究報道具有抗菌防腐作用，可以作為防腐保鮮劑的食用香辛料有肉桂、八角、牛至、香葉、百里香、迷迭香、香茅草、丁香、花椒、紫蘇、香芹等幾十種[1-3]。然而腸道益生菌與人類健康的關(guān)系早已成為本世紀(jì)以來生命科學(xué)領(lǐng)域的熱門話題?？茖W(xué)研究者篩選天然食品防腐劑只關(guān)注其對有害菌的抑制作用，是否這些防腐劑也抑制益生菌增殖，或者靶向抑制有害菌而對益生菌沒有作用，甚至促進益生菌增殖，近年一些研究報道了食用香料能夠促進益生菌的生長[4]，更多的研究需要篩選驗證食用香料對食源性致病菌和益生菌的雙向作用?；诖耍疚倪x取6種常用香料為研究對象，選取4株食源性致病菌和4株益生菌為受試菌株，探究香料水提物對兩類菌的抑制效果，為篩選評價既能防腐保鮮又能促進腸道菌群健康的天然香料做理論探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌種

肉桂（樟科，樟屬，肉桂種，產(chǎn)自廣西）、白胡椒（胡椒科，胡椒屬，胡椒種，產(chǎn)自廣西）、花椒（蕓香科，花椒屬，花椒種，產(chǎn)自四川）、孜然（傘形科，孜然芹屬，孜然芹種，產(chǎn)自新疆）、八角（八角科，八角屬，八角種，產(chǎn)自廣西）、香葉（樟科，月桂屬，月桂種，產(chǎn)自廣東）：無錫市農(nóng)貿(mào)市場。MRS、MH肉湯培養(yǎng)基：北京鼎國生物科技有限公司。本次試驗所用的4株益生菌分別為副干酪乳桿菌 （L.paracasei JLUS66）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus JLUS37）、植物乳桿菌（L.plantarum JLUS78）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus JLUS46）菌：由吉林大學(xué)食品學(xué)院分離鑒定儲存并友情饋贈。4株食源性致病菌包括大腸桿菌（E.coli ATCC 8735）、金黃色葡萄球菌（S.aureusATCC3101）、鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）：由吉林大學(xué)人獸共患病研究所儲存并友情饋贈。

1.2 儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3750型）：三洋電機株式會社；生化培養(yǎng)箱（spx-250B-Z型）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生物安全柜（05J02-C型）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀（FC型）：上海賽默飛世爾有限公司；真空冷凍干燥機（ES-2030型）：日本日立公司。

1.3 天然植物（香辛料）粗提物及溶液制備

桂皮、白胡椒、花椒、孜然、八角和香葉在40℃干燥箱烘干24 h，經(jīng)粉碎處理過80目篩，各稱取50.0 g粉末于燒杯中，與蒸餾水按料液比為1∶10（g/mL）進行混合后，置于60℃恒溫水浴鍋中提取8 h，離心取上清，將上清液用懸蒸法在60℃溫度下，濃縮4 h。將濃縮得到的液體轉(zhuǎn)平皿中，冷凍干燥得到粉末狀的粗提物。

提取物溶液的配置：分別稱取6種粉末狀粗提物250.0 mg，配制成5 mg/mL的儲備溶液，并用0.22 μm濾膜過濾，置于50 mL離心管中，用封口膜封口，置于4℃冰箱中備用。

1.4 試驗菌懸液的制備

從4℃冰箱儲存的固體瓊脂板上挑取單菌落，益生菌接種在MRS液體培養(yǎng)基中，致病菌接種在MH肉湯培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h～48 h至對數(shù)生長期，待用。

1.5 抑菌活性檢測

1.5.1 抑菌圈（DIZ）的測定

DIZ的測定采用雙層瓊脂擴散法，先以1%的無菌瓊脂水溶液在培養(yǎng)皿底層打底，待瓊脂凝固后均勻擺放牛津杯，再倒20 mL帶有指示菌的固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后取牛津杯，在其形成的孔內(nèi)加0.2 mL各香料粗提物溶液，37℃培養(yǎng)24 h后測DIZ直徑，單位為mm，DIZ小于8 mm判定為無抑菌圈（NIZ）。

1.5.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定

最小抑菌濃度測定采用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法[5]，將復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌懸液用麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尩?×105cfu/mL，用移液器取100 μL分別加入96孔板的中間的6×10孔，周圍36孔加無菌水保濕。將5 mg/mL的香料提取物溶液用滅菌蒸餾水二倍稀釋，得到濃度梯度為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL的稀釋液液，分別取100 μL加入96孔板加過菌懸液的各孔，每個濃度梯度加一排6個孔，各受試組實際藥物終濃度分別為2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1、0.019 5 mg/mL。青霉素做陽性對照。37℃培養(yǎng)24 h后，用MTT進行活細胞染色，肉眼觀察無顯色反應(yīng)的最小藥物濃度孔的藥物濃度判斷為MIC。

1.5.3 最小殺菌濃度（MBC）的測定

MBC的測定參照代如意[6]的方法。將MIC檢測中未見細菌生長的各孔菌液，采用平板涂布法進行計數(shù)，以肉眼觀察菌落不生長視為100%被殺滅，此最低藥物濃度值為其MBC值。

1.6 統(tǒng)計

所用試驗分別做3個平行，使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，抑菌圈值用±SD表示。

2 結(jié)果

6種食用香料粗提物對4株食源性致病菌的抑菌活性及對4種益生菌的作用見表1、表2。

表1 6種食用香辛料粗提物對4株食源性致病菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of 6 kinds of food spices extracts on 4 foodborne pathogens

表2 6種香辛料提取物對4種益生菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activities of 6 kinds of food spices extracts on 4 probiotics

2.1 抑菌圈測定

雙層瓊脂擴散法測定6種食用香料提取物對4種食源性致病菌均表現(xiàn)出抑菌活性。如表1所示，肉桂、八角和香葉提取物對該4種食源性致病菌的抑菌圈較大 。 肉 桂 提 取 物 對 B.subtilis、E.coli、S.aureus、S.typhimurium4種菌的抑菌圈分別為（17.3±1.5）mm、（18.5±1.0）mm、（14.7±1.1）mm、（10.2±0.9）mm，抑菌活性最強。白胡椒、花椒和孜然對4種菌都產(chǎn)生相對較小的抑菌圈（8.6±0.5）mm～（11.2±1.3）mm，而鼠傷寒沙門菌對花椒、孜然和香葉提取物均不敏感，沒有抑菌圈出現(xiàn)。相反的，在6種香料提取物對4種益生菌的抑菌圈試驗中，除植物乳桿菌表現(xiàn)對肉桂、八角和香葉提取物敏感，都出現(xiàn)了抑菌圈，分別為（9.1±0.60）mm、（10.2±1.6）mm、（8.7±0.9）mm。其他均未見明顯抑菌圈（見表2）。

2.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定

微量肉湯稀釋法測定6種香料提取物對4株食源性致病菌和4株益生菌的結(jié)果與抑菌圈測定結(jié)果基本對應(yīng)。從表1可見，肉桂、八角和香葉提取物對4種食源性致病菌的MIC值分別為0.625、0.625 mg/mL和1.25 mg/mL，表現(xiàn)出較強的抑菌活性。白胡椒、花椒和孜然提取物對4種食源性致病菌的MIC值都≥2.5 mg/mL。肉桂和八角對4種致病菌的MBC值，除肉桂對 S.aureus外（0.625 mg/mL）都是 1.25 mg/mL，其余都為獲得明確的MBC值都≥2.5 mg/mL。6種提取物對4種益生菌的MIC值和MBC值都2.5 mg/mL。

3 討論

目前有114個品種的香辛料經(jīng)由國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）確認并列入標(biāo)準(zhǔn)[5]。因其秉承了“藥食同源”的傳統(tǒng)飲食觀念，近年來，國內(nèi)外學(xué)者對香辛料的化學(xué)成分和生物活性進行了廣泛而深入的研究，其中抗氧化和抗菌活性是主要的研究熱點。天然食用香辛料中含有多種抗菌活性成分。本研究采用水提法獲得6種食用香料粗提物，經(jīng)抑菌圈實驗，MIC和MBC測定，6種粗提物對4種常見食品腐敗菌和致病菌都表現(xiàn)出抑菌活性。其中肉桂提取物的抑菌活性最強，對4種致病菌和腐敗菌的MIC均是0.625 mg/mL。肉桂含有肉桂醛、肉桂酸等多種抗菌成分，被許多報道驗證。何珊等[8]采用硅膠柱色譜等多種色譜分離技術(shù)從肉桂的乙醇提取物中分離得到香豆素、肉桂酸、2－羥基－4－甲氧基肉桂醛等12種化合物。張赟彬等[9]用濾紙片法測得肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為21.75、29.37 mm，MIC 值和 MBC 值分別為 0.25 μL/mL和0.5 μL/mL。南洋等[10]從肉桂醇提取物中鑒定出香豆素、桂皮醇、桂皮醛、桂皮酸、2－甲氧基桂皮醛、十八烷二烯酸甲酯6種化學(xué)成分。其提取物對肉中常見的腐敗菌和致病菌包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、青霉菌、啤酒酵母均有較強的抑制作用。楊敏等[11]用不同有機相提取胡椒中的抗菌成分，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等5株受試菌的MIC值為2.5 mg/mL～20 mg/mL。麻琳等[12]采用水蒸氣蒸餾法提取漢源紅花椒、江津青花椒、峨眉山藤椒果皮精油，經(jīng)GC－MS分析芳樟醇是3種精油的主要揮發(fā)性成分，并通過抑菌圈實驗和二倍稀釋法研究其抑菌特性，經(jīng)比較，金黃色葡萄球菌對紅花椒精油最敏感，MIC值為0.31 mg/mL。有研究報道[13]，孜然中的主要抑菌成分為枯茗醛和枯茗酸。王同禹等分析八角茴香水溶性揮發(fā)組分的主要成分為大茴香醛、對丙酮基茴香醚和大茴香酸。八角茴香水溶性揮發(fā)成分對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、黑曲霉、黃曲霉和桔青霉的最小抑菌濃度分別為0.625 mL/L～20 mL/L[14]。唐暉慧[15]采用水蒸氣蒸餾法收集艾納香葉精油，對金黃色葡萄球菌的MIC為625 μg/mL，對大腸桿菌、李斯特氏菌和沙門氏菌的MIC為2 500 μg/mL。本文的研究結(jié)果與這些報道基本吻合，卻并非報道中都得到了很高的抗菌活性，這可能是不同的提取方法獲得有效成分差異。

益生菌是指一類能夠在人體腸道生存，并能夠通過各種調(diào)節(jié)功能改善人體健康的一類健康菌群。益生菌被譽為是人體“第二大腦”，研究表明，益生菌有抗過敏、調(diào)節(jié)腸道功能，增強免疫，甚至是降糖、降壓、抗腫瘤，治療獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病等功效[16]。醫(yī)學(xué)界始終關(guān)注抗生素的大量使用會破壞人體腸道菌群，然而對食品中使用的防腐劑是否能夠破壞腸道菌群卻很少關(guān)注。從天然植物原料篩選被認為是安全綠色的食品防腐劑的同時，兼顧考慮其對腸道菌群的作用意義深遠。本文比較了6種食用香料分別對食源性致病菌和益生菌的不同作用。結(jié)果表明6種食用香料提取物能夠抑制有害菌，然而除八角、香葉提取物對植物乳桿菌出現(xiàn)較小的抑菌圈外[（10.2±1.6）mm，（8.7±0.9）mm]，其他都沒有發(fā)現(xiàn)對受試益生菌產(chǎn)生抑制。在本試驗濃度范圍內(nèi)，所有提取物對受試益生菌株都沒有獲得MIC和MBC值（均＞2.5 mg/mL），這是令人可喜的。一些學(xué)者也曾得到過類似的結(jié)果。Puupponen等[17]研究表明，漿果多酚類化合物能夠選擇性抑制沙門氏菌和表皮葡萄球菌，卻對乳酸桿菌沒有作用。Lee等[18]研究茶多酚也獲得類似結(jié)果。許多研究證明石榴皮提取物的抑菌活性[19]，而Bialonska等報道石榴皮提取物對嗜酸乳桿菌，干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌都沒有抑制作用。為什么致病菌比乳酸菌對這些天然抑菌成分更為敏感，這是值得深入探討的問題。其可能機制為，一方面，益生菌本身在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)酸，帶有與身俱來的耐酸機制[21]；另一方面，可能是益生菌能夠代謝解毒天然植物中的酚醛成分[22]。更多的機制需要進一步研究。

4 結(jié)論

本研究用水提法獲得6種食用香辛料的水提物，并分別利用抑菌圈試驗，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度檢測了6種水提物分別對4種食源性致病菌和4種益生菌的抑制活性。結(jié)果表明，除花椒、孜然和香葉提取物對鼠傷寒沙門氏菌未見明顯抑制作用，其他提取成分對4種食源性致病菌都表現(xiàn)明顯抑制作用。而對4種益生菌的試驗結(jié)果表明，除肉桂、八角和香葉提取物對植物乳桿菌表現(xiàn)抑制作用，6種水提物對其他3種益生菌均未見明顯抑制作用。因此可以認為，許多食用香料提取成分能夠選擇性的抑制有害菌而不抑制有益菌，從自然界的植物中篩選開發(fā)天然食品防腐劑能給人們帶來實實在在健康安全的食品。

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