孫靜，賀曉光，張津瑜，杜文斌，章中

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

芽孢的殺滅是食品殺菌的關(guān)鍵任務(wù)。芽孢是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件下形成的休眠態(tài)，可以休眠幾萬(wàn)年以上而復(fù)活，對(duì)各種殺菌處理（如輻照、超高壓、熱、超聲波、微波、化學(xué)物質(zhì)等）有極強(qiáng)的抗性[1]。然而，當(dāng)萌發(fā)條件適宜時(shí)，芽孢便迅速萌發(fā)、出芽生長(zhǎng)，一旦其恢復(fù)到營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)便喪失了對(duì)外界脅迫的抵抗力[2-3]。許多因素能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，如營(yíng)養(yǎng)素、超高壓、陽(yáng)離子表面活性劑、機(jī)械擦傷、外源DPA、外源裂解酶、細(xì)胞壁碎片等等[4-5]。自然界中芽孢的萌發(fā)多是由一些營(yíng)養(yǎng)類(lèi)的萌發(fā)劑觸發(fā)，包括氨基酸、糖類(lèi)和嘌呤核苷類(lèi)等，也可以由多種營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑聯(lián)合觸發(fā)[6]。

在芽孢萌發(fā)而轉(zhuǎn)變成營(yíng)養(yǎng)體的過(guò)程中，皮層裂解酶會(huì)將芽孢皮層肽聚糖水解，這是芽孢萌發(fā)過(guò)程中的一個(gè)重要步驟[7]。皮層裂解酶是芽孢所特有的酶，專(zhuān)一地水解芽孢皮層肽聚糖，在休眠的芽孢中，皮層裂解酶不表現(xiàn)出活性，當(dāng)芽孢萌發(fā)時(shí)，皮層裂解酶會(huì)通過(guò)某種機(jī)制被激活并將皮層肽聚糖水解[8]。高壓熱殺菌技術(shù)（High-pressure thermal sterilization，HPTS）將壓力和溫度結(jié)合起來(lái)殺菌，對(duì)細(xì)菌芽孢有良好的殺滅作用[9]。有研究推測(cè)，HPTS很可能會(huì)影響皮層裂解酶的活性，在某些壓力和溫度條件下，皮層裂解酶可能會(huì)被激活，導(dǎo)致芽孢皮層水解，進(jìn)而使得芽孢結(jié)構(gòu)被破壞[10]。然而，要驗(yàn)證高壓熱處理是否能激活芽孢皮層裂解酶，首先要提取皮層裂解酶，測(cè)定分子量，為皮層裂解酶的分離及純化打下基礎(chǔ)，進(jìn)而對(duì)皮層裂解酶進(jìn)行HPTS處理，從而揭示HPTS殺滅芽孢的機(jī)理，闡明HPTS對(duì)皮層裂解酶結(jié)構(gòu)和活性的影響。

本試驗(yàn)使用DPA、L-丙氨酸、肌苷等來(lái)誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，芽孢萌發(fā)后皮層裂解酶會(huì)釋放到萌發(fā)液中，經(jīng)透析處理，從萌發(fā)液中提取芽孢皮層裂解酶粗酶液，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析其分子量并測(cè)定其活性。本文對(duì)皮層裂解酶的最佳提取方法及電泳條件進(jìn)行優(yōu)化，建立適宜于枯草芽孢桿菌芽孢皮層裂解酶的提取條件和SDS-PAGE電泳技術(shù)，確定皮層裂解酶粗酶液中各蛋白分子量，為皮層裂解酶的進(jìn)一步分離純化提供材料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號(hào)As 1.433。

1.1.2 主要試劑

2，6-吡啶二羧酸（DPA）：分析純，美國(guó) Sigma公司；L-丙氨酸、肌苷：上海瑞永生物科技有限公司；30%丙烯酰胺溶液：北京雷根生物科技有限公司；4×Tris/SDS分離膠緩沖液（pH8.8）、4×Tris/SDS濃縮膠緩沖液（pH6.8）：上海雙螺旋生物科技有限公司；過(guò)硫酸銨溶液、TEMED、甘氨酸：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；寬范圍預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：Thermo Scientific；無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠，均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

促芽孢生長(zhǎng)錳鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：向普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入MnSO4·H2O（使得培養(yǎng)基中Mn2+的濃度為50 mg/L），調(diào)pH值，滅菌，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平、FE28型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DSX-280B型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；XMTD-6000型電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-10C型冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海馳唐電子有限公司；DYCZ-24DN型電泳槽：北京六一生物科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌芽孢的培養(yǎng)及菌懸液制備

芽孢的制備方法來(lái)自文獻(xiàn)[11]。菌種用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化3代以上后，接入試管斜面促芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。在37℃培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)和無(wú)菌去離子水將試管斜面上的芽孢洗滌收集到離心管里。然后用冷的無(wú)菌去離子水離心洗滌芽孢3次。離心條件為7 000 r/min、4℃、15 min。離心后將上清液和沉淀的上部一起倒掉。純化后的芽孢重懸在無(wú)菌去離子水中，濃度約為1.5×109CFU/mL，放在4℃下保存，一個(gè)月內(nèi)使用。試驗(yàn)前將枯草芽孢桿菌芽孢調(diào)整到1.5×108CFU/mL左右。

1.3.2 皮層裂解酶的提取[12-15]

1.3.2.1 DPA誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)提取皮層裂解酶

將芽孢濃度稀釋至1.5×108CFU/mL左右，將DPA濃度設(shè)定為10、15、20 mmol/L。將芽孢置于6倍體積的不同濃度萌發(fā)液中，放置于32℃的水浴鍋中處理，每10 min測(cè)定一次OD600值。處理50 min后再經(jīng)離心（8 000 r/min、10 min、4℃），將上清液在4℃透析處理24 h，對(duì)照液為2 L、75 mmol/L、pH值為7.0的磷酸鈉緩沖液，緩沖液中含有1 mmol/L的EDTA、1 mmol/L的巰基乙酸鈉。透析后的酶液進(jìn)行超濾濃縮。對(duì)照組為1 mL芽孢懸浮液加入6 mL無(wú)菌水。

1.3.2.2 肌苷誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)提取皮層裂解酶

將芽孢濃度稀釋至1.5×108CFU/mL左右，將肌苷濃度設(shè)定為10、30、50 mmol/L。其他操作同1.3.2.1。

1.3.2.3 L-丙氨酸誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)提取皮層裂解酶

將芽孢濃度稀釋至1.5×108CFU/mL左右，將L-丙氨酸濃度設(shè)定為10、30、50mmol/L。其他操作同1.3.2.1。

1.3.2.4 L-丙氨酸結(jié)合肌苷誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)提取皮層裂解酶

將芽孢置于6倍體積的、pH=7.0的、30 mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，緩沖液中含有10 mmol/L的L-丙氨酸和4 mmol/L的肌苷。32℃下培養(yǎng)，每10 min測(cè)定一次OD600值。其他操作同1.3.2.1。

1.4 電泳樣品的處理

取0.8 mL濃縮后的酶液，加入0.2 mL 5×SDSPAGE蛋白上樣緩沖液，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液（5×）。沸水浴加熱5 min，以充分變性蛋白。置冰上5 min，使用前10 000 r/min離心1 min。

1.5 聚丙烯酰胺垂直板電泳

1.5.1 染色液、脫色液及電泳液的配制[16-17]

染色液：考馬斯亮藍(lán)R-250 1 g，乙醇45%，冰乙酸10%，加水定容至1 000 mL，過(guò)濾后使用。

脫色液：冰乙酸10%，乙醇30%。

5×蛋白質(zhì)電泳緩沖液：Tris 15.1 g，甘氨酸94 g，SDS 5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，使用時(shí)用蒸餾水稀釋5倍。

1.5.2 分離膠、濃縮膠的配制

按表1、表2比例分別配制10%、12%的分離膠和5%的濃縮膠[18]。

表1 5%分離膠的配制Table 1 The preparation of the 5%separation gel

表2 5%濃縮膠的配制Table 2 The preparation of the 5%spacer gel

1.5.3 電泳

SDS-PAGE參考郭堯君等[18]的方法。采用10%、12%的分離膠及5%的濃縮膠。上樣量為5、10、15 μL。電泳時(shí)，在濃縮膠中電壓控制為80 V，走過(guò)濃縮膠后電壓調(diào)為120 V。凝膠板上的樣品溴酚藍(lán)的條帶走至距底端1 cm時(shí)，停止電泳，取下凝膠，在染色器皿中加入100 mL染色液，加蓋，過(guò)夜染色。脫色液脫色，每3 h換一次脫色液，脫色至染色的凝膠經(jīng)脫色后能清晰顯示出蛋白條帶為止。

1.6 測(cè)量蛋白質(zhì)分子量[19]

用卡尺測(cè)量溴酚藍(lán)指示劑和蛋白遷移距離，計(jì)算相對(duì)遷移率（Rm）=蛋白質(zhì)遷移距離/溴酚藍(lán)指示劑遷移距離，以Rm為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線形回歸，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得目標(biāo)蛋白的分子量。

1.7 皮層裂解酶活性的測(cè)定

1.7.1 脫芽孢衣芽孢的制備

脫芽孢衣芽孢的制備參照Makino[14]的研究，并做相應(yīng)的修改。將枯草桿菌芽孢用30 mmol/L SDS、0.2 mol/L 2-巰基乙醇、pH=10.0、0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液在40℃下處理，處理4 h～8 h。再用冷的無(wú)菌去離子水離心洗滌5次。離心條件為7 000 r/min、4℃、15 min。洗滌后的脫芽孢衣芽孢重懸在無(wú)菌去離子水中，濃度約為 1.5×108CFU/mL。

1.7.2 酶活性的測(cè)定

在32℃下，通過(guò)測(cè)定脫芽孢衣芽孢懸浮液的OD600值的減少量來(lái)評(píng)價(jià)酶的活性[14]。取4 mL透析后的粗酶液，于32℃培育20 min，對(duì)照組為4 mL無(wú)菌水32℃下培育20 min，再向各組中加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液，在32℃下反應(yīng)80 min，每10 min測(cè)一次OD600值。

1.8 數(shù)據(jù)分析方法

所有試驗(yàn)都重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 7.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萌發(fā)劑對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的影響

2.1.1 DPA對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

芽孢萌發(fā)時(shí)，其核心部分水化，導(dǎo)致其折光性發(fā)生變化，萌發(fā)后其OD600值顯著下降，并且下降的程度與芽孢萌發(fā)率的高低有顯著的相關(guān)關(guān)系，下降的程度越高，芽孢的萌發(fā)率就越高，因此芽孢懸浮液OD600值的變化被廣泛的用于評(píng)價(jià)芽孢的萌發(fā)程度[20]。

DPA對(duì)芽孢萌發(fā)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 DPA對(duì)芽孢萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of DPA on germination of spores

從圖1可知，與對(duì)照相比，加入DPA的樣品OD600值均有所下降；在前30 min時(shí)，OD600值迅速降低，30 min~40 min時(shí)OD600值下降趨勢(shì)減緩，而40 min~50 min時(shí)，OD600值基本不變，說(shuō)明當(dāng)加入DPA時(shí)，芽孢在30 min內(nèi)能迅速萌發(fā)，30 min~50 min萌發(fā)速率逐漸減弱；隨著DPA濃度的逐漸增大，OD600值下降程度也逐漸增大，當(dāng)DPA濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)，OD600值下降最多，即芽孢萌發(fā)程度最大。

2.1.2 L-丙氨酸對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

L-丙氨酸對(duì)芽孢萌發(fā)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 L-丙氨酸對(duì)芽孢萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of L-alanine on germination of spores

從圖2可以看出，L-丙氨酸濃度為30、50 mmol/L的樣品，在前40 min時(shí)OD600值迅速降低，40 min~50 min時(shí)，OD600值下降趨勢(shì)減慢；而L-丙氨酸濃度為10 mmol/L的樣品，OD600值在前10 min內(nèi)迅速降低，10 min~50 min OD600值下降趨勢(shì)逐漸減緩；說(shuō)明當(dāng)加入L-丙氨酸時(shí)，芽孢能在較短時(shí)間內(nèi)萌發(fā)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，萌發(fā)速率逐漸減弱；隨著L-丙氨酸濃度的不斷增大，OD600值下降趨勢(shì)逐漸最大，說(shuō)明芽孢的萌發(fā)程度隨著L-丙氨酸濃度增大而逐漸增大。

2.1.3 肌苷對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

肌苷對(duì)芽孢萌發(fā)的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，在前30 min時(shí)，OD600值迅速降低，30 min~50 min時(shí)，肌苷濃度為10、30 mmol/L的樣品OD600值下降趨勢(shì)減緩，而肌苷濃度為50 mmol/L的樣品，30 min~50 min時(shí)，OD600值仍有明顯的下降趨勢(shì)，但較前30 min下降趨勢(shì)有所減小，說(shuō)明當(dāng)加入肌苷時(shí)，芽孢在30 min內(nèi)能迅速萌發(fā)；隨著肌苷濃度的逐漸增大，OD600值下降程度也逐漸增大，當(dāng)肌苷濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí)，OD600值下降最多，即芽孢萌發(fā)程度最大。

圖3 肌苷對(duì)芽孢萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of inosine on germination of spores

2.1.4 L-丙氨酸結(jié)合肌苷對(duì)芽孢萌發(fā)的影響

L-丙氨酸結(jié)合肌苷對(duì)芽孢萌發(fā)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 L-丙氨酸結(jié)合肌苷對(duì)芽孢萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of L-alanine combined with inosine on germination of spores

從圖4可知，加入L-丙氨酸結(jié)合肌苷（緩沖液中含有10 mmol/L的L-丙氨酸和4 mmol/L的肌苷）的樣品與對(duì)照組相比，OD600值有極顯著的降低（P＜0.01）；隨著培育時(shí)間的延長(zhǎng)，OD600值逐漸降低，前40 min OD600值下降趨勢(shì)明顯，40 min~50 min時(shí)，下降趨勢(shì)減弱。

對(duì)各因素誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的效果進(jìn)行了差異顯著性分析，DPA誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的效果顯著高于其他3種芽孢萌發(fā)誘導(dǎo)劑（P＜0.05）。因此本試驗(yàn)選用DPA誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)來(lái)提取皮層裂解酶。

2.2 枯草芽孢桿菌芽孢皮層裂解酶粗酶SDS-PAGE電泳結(jié)果

對(duì)皮層裂解酶粗酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，由于酶的濃度較低，在凝膠板上并未看到蛋白條帶，將酶液進(jìn)行超濾濃縮后再次進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖5。

圖5 分離膠濃度為12%的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of the separation gel concentration of 12%

由圖5可以看出，進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，只能看到蛋白跑過(guò)的印跡，無(wú)明顯可見(jiàn)條帶，進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，能大致看到蛋白條帶，但條帶仍不清晰，隨著進(jìn)樣量的逐漸增大，蛋白條帶逐漸清晰，增大進(jìn)樣量至15 μL，能看到清晰的蛋白條帶；但各條帶之間的距離很小，整體分離效果并不良好。

調(diào)節(jié)分離膠濃度為10%，結(jié)果如圖6。

圖6 分離膠濃度為10%的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of the separation gel concentration of 10%

圖7 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of molecular weight of protein

可以看出，各蛋白條帶間距明顯拉開(kāi)，分離效果較好。電泳時(shí)，在相對(duì)較高濃度分離膠系統(tǒng)中，由于凝膠孔徑相對(duì)較小，樣品分子的移動(dòng)速度因受阻較大而減緩，遷移率就相對(duì)較低，對(duì)于較大分子量的蛋白而言，所受阻力較大，分離效果較差；在相對(duì)較低濃度分離膠系統(tǒng)中，由于凝膠孔徑相對(duì)較大，樣品分子的移動(dòng)只是稍受阻礙，對(duì)于較大分子量的蛋白而言，遷移速度較快，遷移率較高，分離效果較好。從圖5-c和6-c可以看出，10%與12%的凝膠系統(tǒng)相比，分子量為48.64 kDa和43.25 kDa的兩種蛋白，在10%的凝膠系統(tǒng)中分離效果更好。所得的PAGE圖像中有多條蛋白條帶，但條帶的強(qiáng)弱有所不同，有4條蛋白條帶較為清晰，通過(guò)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖7）可得出，皮層裂解酶粗酶液中蛋白分子量大約分別為：61.10、48.64、43.25、31.28 kDa。Makino[14]分離純化蠟樣芽孢桿菌芽孢萌發(fā)時(shí)放出的一種皮層裂解酶，經(jīng)SDS-PAGE電泳法測(cè)得皮層裂解酶分子量大約為24 kDa；Miyata[13]純化梭狀芽孢桿菌S40芽孢皮層裂解酶得到的皮層裂解酶分子量為31.0 kDa；Simon[21]在研究一種萌發(fā)專(zhuān)一性的巨大芽孢桿菌皮層裂解酶的純化和性質(zhì)時(shí)，純化出的皮層裂解酶分子量為29 kDa。本試驗(yàn)所提取的皮層裂解酶粗酶液中，尚不能確定哪一種蛋白質(zhì)為皮層裂解酶，后期將根據(jù)圖6c中分離出來(lái)的4種蛋白質(zhì)的分子量，選擇合適的分離純化手段，將皮層裂解酶進(jìn)一步分離純化出來(lái)。

2.3 酶活性的測(cè)定

為確定所提取到的粗酶液中確實(shí)含有皮層裂解酶，檢測(cè)了粗酶液的皮層裂解活性，結(jié)果如圖8所示。

圖8 酶活性的測(cè)定Fig.8 Determination of enzyme activity

與對(duì)照相比，加入粗酶液的脫芽孢衣芽孢懸浮液的OD600值有極顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明粗酶液中含有皮層裂解酶，但具體哪種分子量的蛋白質(zhì)為皮層裂解酶還需進(jìn)一步的分離純化和鑒定。本文的試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步分離純化皮層裂解酶提供基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：DPA、L-丙氨酸、肌苷及L-丙氨酸結(jié)合肌苷對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢均有誘導(dǎo)萌發(fā)的作用。DPA誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)效果最好，很低濃度的DPA就能迅速誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)。提取出的皮層裂解酶粗酶液經(jīng)透析、超濾濃縮后進(jìn)行SDS電泳，進(jìn)樣量從5 μL 逐漸增大到 15 μL，當(dāng)進(jìn)樣量增大至 15 μL 時(shí)，在凝膠板上能看到清晰的蛋白條帶；10%的凝膠系統(tǒng)上的條帶較12%的相比，各條帶間距更大，整體分離效果更好，因此選擇10%的分離膠濃度更為合適。通過(guò)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出，皮層裂解酶粗酶液中蛋白分子量大約分別為：61.10、48.64、43.25、31.28 kDa，可根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果選擇進(jìn)一步分離純化皮層裂解酶的手段和條件。

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