周凱文，陳曉默，劉慧琳，王靜

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京100048）

晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）是食品加工和貯藏過程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的一類不可逆產(chǎn)物。大量的臨床和動物實驗表明，AGEs在人體內(nèi)的積累與糖尿病及其并發(fā)癥的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系[1-2]。因此，近年來，關(guān)于AGEs的抑制研究成為醫(yī)學(xué)研究的熱點，相關(guān)研究證明了抑制劑如氨基胍在體內(nèi)可顯著減少蛋白的糖基化，在很大程度上能夠減緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[3]，但Ⅲ期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)氨基胍會導(dǎo)致機(jī)體的不良反應(yīng)而使其無法應(yīng)用于臨床實踐。因此天然產(chǎn)物對AGEs的抑制作用逐漸受到科研工作者的關(guān)注，且不斷有新的研究證明，一些天然產(chǎn)物提取物對AGEs有較好的抑制效果，例如，肉桂樹皮中的活性組分兒茶素、表兒茶素和原花青素B2對AGEs有較高的抑制活性[4]，黃芪中分離出的黃芪皂苷和三萜系化合物同樣能夠抑制羧甲基賴氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）的形成[5]。

甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）是美拉德反應(yīng)的一個重要中間產(chǎn)物。在生理條件下，MGO能夠不可逆地修飾蛋白質(zhì)生成AGEs，從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能紊亂[6]。因此可以通過捕獲MGO來抑制AGEs的產(chǎn)生。而Yoon等學(xué)者也證明了魚腥草中的多酚類物質(zhì)可以通過捕獲MGO來抑制AGEs[7]。Lo C Y等發(fā)現(xiàn)綠茶中的黃烷酮類化合物在模擬體系中可以有效清除MGO從而能夠有效的抑制AGEs[8]。

本文研究了來自不同食品原材料或者食源性藥材中的多酚黃酮類化合物對模擬體系中AGEs的抑制效果，通過對AGEs的熒光產(chǎn)物和非熒光產(chǎn)物CML的抑制效果進(jìn)行評價，探究這些物質(zhì)與MGO的加和反應(yīng)以及可能生成的加和產(chǎn)物，為天然性藥物的開發(fā)與使用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基胍：北京半夏生物科技有限公司；茶多酚、兒茶素、大豆異黃酮、染料木素、大豆黃素、原花青素、木犀草素、沒食子酸、白藜蘆：上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑、甲醇、β-巰基乙醇、濃硫酸、苯酚、鹽酸、氨水：北京化工廠；牛血清白蛋白、葡萄糖、碳酸鈉、丙酮、氫氧化鈉、四硼酸鈉、Nα-乙?；?L-賴氨酸、硼酸鈉、硼酸、硼氫化鈉、三氯乙酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；甲醇、乙腈、乙酸、三氟乙酸（色譜純）：北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

3K15高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma Laborzentrifugen GmbH；BioTek Synergy H1MDG多功能酶標(biāo)儀：美國 BioTek Instruments，Inc.；UGC-24M 氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；UN30Plus精密強(qiáng)制對流干燥箱：中豪萊伯科技有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；酒精噴燈：濟(jì)南魯盈化工有限公司；KQ-700GVDV多用途恒溫超聲清洗儀：昆山市超聲波清洗器；AL203電子分析天平：瑞士METTLER TOLEDO；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Starter2000pH計：美國奧豪斯（上海）有限公司；G9821A紫外-可見分光光度計、Agilent LC-MS：美國安捷倫公司；島津液相LC-20（紫外檢測器）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 牛血清白蛋白-葡萄糖模擬體系的制備

分為空白組、氨基胍陽性對照組，茶多酚、兒茶素、大豆異黃酮、染料木素、大豆黃素、原花青素、木犀草素、沒食子酸和白藜蘆醇試驗組。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PB）（0.1 mol/L，pH12）溶解牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和葡萄糖（Glucose，Glu）[9]，并定容至100 mL，使BSA和Glu濃度分別為10 mg/mL和500 mmol/L，分裝于5 mL密封耐高壓高溫玻璃管中，5 mL/管，其中氨基胍、兒茶素、染料木素、大豆黃素、原花青素、木犀草素、沒食子酸和白藜蘆醇1 mmol/L，茶多酚、大豆異黃酮2.5 mg/mL的量將抑制劑加入到玻璃管中，擰緊管蓋，100℃水浴加熱40 min，反應(yīng)結(jié)束后立即取出置于冰水浴冷卻待測，4℃下保存待測。

1.3.2 模擬體系中AGEs的測定

1.3.2.1 模擬體系中熒光產(chǎn)物的測定

將空白組反應(yīng)混合物在熒光激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為450 nm進(jìn)行熒光光譜檢測，記錄模擬體系反應(yīng)混合物的熒光強(qiáng)度，所有檢測均做3次平行。其中熒光產(chǎn)物抑制率的計算公式為：

式中：A1為空白組的熒光強(qiáng)度；A2為加入抑制劑后的熒光強(qiáng)度。

1.3.2.2 模擬體系中非熒光產(chǎn)物CML的測定

參考Assar等[10]的方法并做適當(dāng)?shù)男薷?，取一定量?.3.1中反應(yīng)后的樣品，加入硼酸鈉緩沖溶液（0.5 mol/L，pH9.2）混合至最后的緩沖液濃度為0.2 mol/L，然后加入硼氫化鈉溶液（1 mol/L，0.1 mol/L NaOH配制）至最后硼氫化鈉溶液的濃度為0.1 mol/L，樣品在4℃下還原10 h；還原反應(yīng)結(jié)束后，向樣品中加入60%的三氯乙酸使樣品中的最終濃度為20%，10 000 r/min 4℃下離心分離10 min以沉淀蛋白質(zhì)，獲得的蛋白質(zhì)用丙酮洗滌2次，將蛋白中剩余的丙酮吹干；向沉淀的蛋白加入1 mL6 mol/L的鹽酸110℃下水解24 h，然后用氮氣吹干。將干燥的蛋白質(zhì)水解物重新溶入2 mL水中，用固相萃取柱除雜[具體操作：PCX固相萃取柱預(yù)活化（依次通過3 mL甲醇和3 mL水）[11]，取復(fù)溶的樣品溶液通過預(yù)活化了的PCX固相萃取柱，然后分別用3 mL水和3 mL甲醇沖洗，最后目標(biāo)化合物通過5 mL的甲醇（5%的氨水）洗脫]，最后洗脫液用氮氣吹干，吹干后的樣品重新溶于2 mL水中，然后通過0.45 μm濾膜過濾后用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）測定反應(yīng)體系中CML的含量，所有樣品均做3次平行試驗。

1.3.2.3 HPLC-MS/MS檢測CML的條件

高效液相色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相 A：0.1%三氟乙酸水溶液[12]，B：乙腈（Acetonitrile，ACN）；流速 0.2 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL。梯度洗脫條件為：0～0.5 min（90%A），0.5 min～4.0 min（90%A～60%A）[13]；柱溫：30 ℃；運行時間：25 min。

質(zhì)譜條件：ESI離子源；多反應(yīng)監(jiān)控模式（Multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度 300℃；錐孔電壓1.03×105Pa；毛細(xì)管電壓4 kV；MRM模式的設(shè)置：m/z205.0→m/z84.0[14]。

1.3.3 模擬體系中反應(yīng)前后可用賴氨酸的測定

苯二醛試劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）[9，15]：將 0.1 mol/L 的硼酸緩沖液（pH9.5，50 mL），β-巰基乙醇（0.2 mL）和鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（80 mg溶于2 mL甲醇）混合，去離子水定容至100 mL。將1mL樣品溶液和3 mL OPA試劑混合，立即放置于暗處室溫靜置5 min，然后檢測熒光強(qiáng)度（以O(shè)PA作為空白溶液）。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過不同濃度（10 μmol/L～1 000 μmol/L）的 Nα-乙?；?L-賴氨酸測得。結(jié)果用可用賴氨酸的剩余量來表示（未經(jīng)加熱處理的對照組的可用賴氨酸的量為起始量）。

1.3.4 模擬體系中反應(yīng)前后還原糖的測定

將100 μL稀釋樣品置于玻璃瓶中，加入300 μL濃硫酸和60 μL5%苯酚，90℃保溫5 min，迅速冷卻到室溫靜置5 min。取200 μL反應(yīng)液加入到96孔板中在490 nm下檢測吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過不同濃度葡萄糖（5 μg/孔～40 μg/孔）的檢測制得[16]。

1.3.5 多酚黃酮類物質(zhì)對MGO捕獲研究

1.3.5.1 MGO反應(yīng)模型的制備

取不同的多酚和黃酮類化合物（1 mmol/L）與甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）（3 mmol/L）在磷酸緩沖液中混合，100℃下加熱40 min，然后取200 μL反應(yīng)液加入1 μL的醋酸溶液以終止反應(yīng)，每個樣品中加入200 μL鄰苯二胺（100 mmol/L）用于對剩余MGO的衍生化，氨基胍作為陽性對照[17]。反應(yīng)結(jié)束后使用固相萃取（Solid phase extraction，SPE）技術(shù)進(jìn)行除雜，取預(yù)活化（3 mL甲醇和3 mL超純水）過的C18固相萃取柱上樣，然后用3 mL水沖洗，而后用2 mL甲醇洗脫收集，過0.45 μm膜后待測。

1.3.5.2 HPLC-MS/MS檢測MGO的條件

色譜條件為色譜柱：InertsilODS-4（4.6mm×150mm，5 μm）；流動相 A：0.2%乙酸，90%水，10%甲醇，流動相B：0.2%乙酸和100%甲醇；梯度洗脫順序：0～1.5 min，0%～20%B；1.5min～2.5 min，20%～35%B；2.5 min～4.5 min，35%～100%B；4.5 min～5.5 min，100%B；5.5 min～5.6 min，100%～0%B，5.6 min～7.0 min，0%B，進(jìn)樣量 5 μL，流速 0.5 mL/min[18]。

質(zhì)譜條件：ESI離子源；多反應(yīng)監(jiān)控模式（MRM）；離子源溫度300℃；錐孔電壓1.03×105Pa；毛細(xì)管電壓4 kV；Scan模式掃譜和單離子模式捕獲（Single ion monitoring，SIM）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用spss20軟件處理數(shù)據(jù)，以Excel2007軟件繪圖。顯著性分析P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行試驗取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 多酚和黃酮類化合物對模擬體系中AGEs熒光產(chǎn)物的抑制

多酚和黃酮類化合物對模擬體系中AGEs熒光產(chǎn)物的抑制效果見圖1。

圖1 多酚和黃酮類化合物抑制模型組中熒光產(chǎn)物的生成量Fig.1 The fluorescence generation in the inhibition model group of polyphenols and flavonoids

從圖1中可以看出，茶多酚和木犀草素對AGEs熒光產(chǎn)物的抑制效果是最明顯的，其中對熒光產(chǎn)物的抑制率茶多酚達(dá)到了68.52%，木犀草素達(dá)到了61.19%。沒食子酸和大豆黃素對AGEs熒光產(chǎn)物基本沒有抑制效果，白藜蘆醇和染料木素對AGEs熒光產(chǎn)物的抑制效果沒有顯著性差異，抑制率分別為21.54%和23.03%（P＜0.05），大豆異黃酮和原青花素組對AGEs熒光產(chǎn)物的抑制效果沒有顯著性差異，抑制率分別為18.73%和17.17%。而陽性對照組氨基胍在堿性環(huán)境中對熒光產(chǎn)物的生成沒有抑制效果，氨基胍抑制熒光產(chǎn)物的作用原理是在Amadori重排產(chǎn)物形成葡萄糖－蛋白質(zhì)衍生的交聯(lián)產(chǎn)物之前與Amadori重排產(chǎn)物氨基酮競爭性結(jié)合成無活性的替代性Amadori產(chǎn)物[19]，而在堿性環(huán)境下不利于氨基胍和氨基酮的結(jié)合，而熒光產(chǎn)物主要是由Amadori重排產(chǎn)物衍生出的交聯(lián)產(chǎn)物，因此環(huán)境中氨基胍對AGEs中熒光產(chǎn)物沒有抑制效果。

2.2 多酚和黃酮類化合物對模擬體系中非熒光產(chǎn)物CML的抑制

多酚和黃酮類化合物對模擬體系中非熒光產(chǎn)物CML的抑制效果見圖2。

圖2 多酚和黃酮類物質(zhì)抑制模型組中CML的生成量Fig.2 The CML generation in the inhibition model group of polyphenols and flavonoids

從圖2中可以看出，兒茶素、白藜蘆醇、大豆異黃酮和染料木素組對CML基本沒有抑制效果，與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），此外沒食子酸對CML的抑制效果較差，抑制率僅為6%，其他幾組包括陽性對照組氨基胍對CML都有不同程度的抑制效果，其中大豆黃素和原花青素組對CML的抑制效果沒有顯著性差異，抑制率分別為10.52%、12.08%，茶多酚和木犀草素組對CML的抑制效果較好，抑制率分別為13.67%、16.52%。

比較圖1和圖2可知，茶多酚和木犀草素對AGEs中熒光產(chǎn)物和對CML的抑制較其他活性物質(zhì)效果好。而白藜蘆醇、染料木素和大豆異黃酮對熒光產(chǎn)物的抑制效果較好，但是對CML基本沒有抑制效果，這說明白藜蘆醇、染料木素和大豆異黃酮中的活性物質(zhì)可能參與到了Amadori重排產(chǎn)物衍生成交聯(lián)熒光產(chǎn)物的過程，而沒有參與到席夫堿裂解成活性羰基繼而和賴氨酸（Lysine，Lys）生成CML的過程、以及葡萄糖自氧化生成CML的過程。相反的，大豆黃素對CML有顯著性抑制效果，但是對熒光產(chǎn)物沒有抑制效果，這說明大豆黃素可能不參與Amadori重排產(chǎn)物衍生成熒光交聯(lián)產(chǎn)物的過程。比較染料木素和大豆異黃酮對AGEs中熒光產(chǎn)物和CML的抑制效果以及大豆黃素對兩者的抑制效果可以看出，在大豆異黃酮中對AGEs產(chǎn)生抑制效果的活性物質(zhì)主要為染料木素而非大豆黃素。比較茶多酚組和兒茶素組對熒光產(chǎn)物和CML的抑制效果可以看出，茶多酚中對AGEs產(chǎn)生抑制效果的活性物質(zhì)中兒茶素所占比例較小。此外，值得關(guān)注的是，葡萄籽提取物原花青素以及存在與許多中藥材和許多蔬菜中的木犀草素對AGEs中熒光產(chǎn)物和CML都有較顯著的抑制效果，這些從天然食物或者藥材中提取的活性物質(zhì)有很大的潛力用于替代氨基胍等一些存在副作用的藥物。

2.3 不同抑制模擬體系中賴氨酸含量的變化

不同抑制模擬體系中賴氨酸含量的變化見圖3。

圖3 多酚和黃酮類物質(zhì)抑制模型組中可用賴氨酸殘基含量Fig.3 Available lysine residues in the inhibition model group of polyphenols and flavonoids

圖3中可以看出，大豆異黃酮組的游離氨基量較大，說明糖基化程度較低，氨基胍、白藜蘆醇和染料木素組的糖基化反應(yīng)程度最高，差異不顯著（P＞0.05）。從多酚和黃酮類物質(zhì)抑制模型組中的熒光產(chǎn)物和CML的生成量與反應(yīng)后可用賴氨酸的剩余量可知，抑制模型組中AGEs熒光產(chǎn)物與CML的生成量和可用賴氨酸的量沒有必然的聯(lián)系，對AGEs有較好抑制效果的茶多酚和木犀草素中賴氨殘基的剩余量也較少，有可能是這些活性物質(zhì)通過與賴氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)來抑制葡萄糖對蛋白質(zhì)的糖基化從而達(dá)到對AGEs的抑制作用。

2.4 不同抑制模擬體系中還原糖含量的變化

不同抑制模擬體系中還原糖含量的變化見圖4。

圖4 多酚和黃酮類物質(zhì)抑制模型組中還原糖剩余含量Fig.4 Reducing sugar content in the inhibition model group of polyphenols and flavonoids

圖4中可以看出，參與反應(yīng)的活性羰基主要來自于原料中的還原糖。還原糖消耗最多的為茶多酚和沒食子酸組，而還原糖消耗最少的為大豆異黃酮組，這一點與可用賴氨酸的消耗規(guī)律相似，抑制模型組中AGEs熒光產(chǎn)物與CML的生成量和剩余還原糖的量沒有必然的聯(lián)系。

2.5 多酚黃酮類化合物對MGO的捕獲

原花青素單體在280 nm的掃描圖如圖5所示，圖6是原花青素和MGO的加和產(chǎn)物的液相譜圖和質(zhì)譜圖。

圖5 原花青素的液相掃描圖Fig.5 Procyanidins liquid chromatogram and mass spectra

圖6 原花青素加合物的液相色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.6 The liquid chromatogram and mass spectra of procyanidins adducts

已知原花青素的分子量為468.42，而MGO的分子量為72.06，從圖中可以看出，540.2為原花青素和MGO的單加合物，而613.1為原花青素和MGO的雙加合物，類似的，其他多酚和黃酮類物質(zhì)通過Scan或SIM模式捕獲到了單加合物和雙加合物。

多酚和黃酮類物質(zhì)和MGO可能存在的加和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)圖見表1。

通過LC－MS/MS可以檢測到不同多酚黃酮類物質(zhì)和MGO都存在加合產(chǎn)物，有研究表明，抑制劑可以通過捕獲MGO來抑制AGEs的含量，并且效果顯著[7－8]，文中選取的多酚黃酮類物質(zhì)可以和MGO生成加合產(chǎn)物，但是除了木犀草素和茶多酚以外對AGEs的抑制效果并不是很顯著，可能是因為對MGO的清除率不高或者因為高溫條件下發(fā)生熱降解。

表1 多酚和黃酮類物質(zhì)和MGO可能存在的單雙加合物Table 1 The possible structures of the flavonids and polyphenols adduct

狹義的黃酮結(jié)構(gòu)和廣義的黃酮結(jié)構(gòu)見圖7。

圖7 狹義黃酮（a）和廣義黃酮（b）的結(jié)構(gòu)Fig.7 The structure of special flavonoids（a）and general flavonoids（b）

研究表明，黃酮的5號位和7號易受到親核攻擊，有研究人員提出，苯環(huán)上有羥基取代時，其臨位比間位和對位更易受到親核攻擊[20]，因此黃酮類衍生物A環(huán)只有7號位或5號位有羥基代基時，最容易發(fā)生親核加成的位置是6號位或者8號位，當(dāng)7號位和5號位同時有羥基取代時，6號位最先發(fā)生加合反應(yīng)；A環(huán)中的活性位置除了6號位其次是8號位。

3 結(jié)論

本課題從食物和天然藥材提取物中選取了一些有代表性的多酚和黃酮類化合物，將其應(yīng)用于美拉德反應(yīng)過程中AGEs的抑制研究。多酚黃酮類化合物對AGEs中熒光產(chǎn)物的抑制實驗表明，茶多酚和木犀草素對熒光產(chǎn)物的抑制效果是最明顯的，其中茶多酚達(dá)到了68.52%，木犀草素達(dá)到了61.19%。多酚黃酮類化合物對CML的抑制實驗表明兒茶素、白藜蘆醇、大豆異黃酮和染料木素組對CML基本沒有抑制效果，茶多酚和木犀草素的抑制效果較好，抑制率為13.67%、16.52%。綜上，來自于茶葉的提取物茶多酚、同時存在與中草藥、花生粕等許多植物中的木犀草素對AGEs有一定的抑制作用，有很大潛力被開發(fā)利用來代替氨基胍等有副作用的藥物成為AGEs的抑制劑。

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