朱彥凱，劉鐵重，伍法清，吳鶴云，謝希賢*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津，300457)

肌苷是一種嘌呤核苷，參與機(jī)體物質(zhì)代謝和能量代謝，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在醫(yī)藥領(lǐng)域，肌苷常用于肝病、心臟病等疾病治療藥物的生產(chǎn)，也用于異丙肌苷和利巴韋林等抗病毒藥物的合成。在食品領(lǐng)域，肌苷是復(fù)合鮮味劑“I+G”的重要原料。此外，肌苷還被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、化工和營(yíng)養(yǎng)保健等諸多領(lǐng)域。目前，主流的肌苷生產(chǎn)方式為微生物發(fā)酵法，該方法利用廉價(jià)的原材料，通過(guò)生物反應(yīng)器的擴(kuò)大培養(yǎng)得到發(fā)酵液，再經(jīng)過(guò)分離純化得到肌苷產(chǎn)品，具有高效、穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點(diǎn)。除此之外，酶解法與化學(xué)分解法也曾用來(lái)生產(chǎn)肌苷，但因其存在較多弊端而被淘汰。

肌苷生物合成途徑包含3個(gè)部分(圖1)：首先，葡萄糖磷酸化后形成6-磷酸葡萄糖，后者經(jīng)磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)生成5-磷酸核糖，在5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate，PRPP)合酶(PRPP synthetase，Prs)的催化下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為PRPP。接著，以PRPP、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)和一碳單位等為前體物，經(jīng)10步酶促反應(yīng)生成肌苷酸(inosine monophosphate，IMP)。最后，IMP在5′-核苷酸酶的催化下生成肌苷。合成途徑冗長(zhǎng)復(fù)雜，還受到嚴(yán)格的反饋調(diào)控，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷的限制因素之一。另外，肌苷的直接前體物IMP存在另外兩條分支途徑，與肌苷支路競(jìng)爭(zhēng)碳代謝流，是限制肌苷合成的另一關(guān)鍵因素。常見的肌苷工程菌株也是主要針對(duì)以上兩個(gè)方面進(jìn)行構(gòu)建。首先是增強(qiáng)肌苷合成途徑及解除限速酶所受反饋調(diào)控。ASAHARA等[1]通過(guò)敲除枯草芽孢桿菌KMBS436的purR基因和嘌呤操縱子核糖開關(guān)，解除了嘌呤合成中的反饋?zhàn)瓒艉娃D(zhuǎn)錄衰減；又通過(guò)優(yōu)化嘌呤操縱子的啟動(dòng)子序列，增強(qiáng)了嘌呤基因的表達(dá)，肌苷產(chǎn)量從1.8 g/L提升至6 g/L。SHIMAOKA等[2]在大腸桿菌I-9m中過(guò)表達(dá)了purFK326Q,P410W和prsD128A突變基因，解除了限速酶反饋抑制，使肌苷產(chǎn)量提高了3.6倍。另外是阻斷肌苷合成過(guò)程的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑。LI等[3]通過(guò)敲除枯草芽胞桿菌BS017中的purA基因來(lái)阻斷腺苷支路，肌苷產(chǎn)量從150 mg/L提升至7.6 g/L。PEIFER等[4]通過(guò)敲除谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的purA和guaB基因，同時(shí)阻斷了腺苷和鳥苷支路，使IMP產(chǎn)量增加了45倍。然而直接阻斷腺苷或鳥苷支路均會(huì)導(dǎo)致菌株?duì)I養(yǎng)缺陷[5]，菌株生長(zhǎng)緩慢，不利于產(chǎn)物生產(chǎn)。因此，適當(dāng)調(diào)節(jié)腺苷和鳥苷合成支路通量，平衡菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，是肌苷工程菌株構(gòu)建的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

在早期研究中，主要通過(guò)誘變枯草芽孢桿菌的方式來(lái)選育肌苷工程菌株，但誘變后的菌株普遍生產(chǎn)穩(wěn)定性偏低，且易發(fā)生負(fù)向突變，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[6]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用代謝工程理論和基因編輯技術(shù)對(duì)野生型菌株進(jìn)行從頭遺傳改造成為肌苷工程菌株構(gòu)建的主要方法。相比芽孢桿菌，大腸桿菌遺傳背景清晰，基因操作簡(jiǎn)便，發(fā)酵周期較短，是發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷另一個(gè)優(yōu)良的宿主。然而，目前已有肌苷生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)效率仍然偏低，且普遍存在攜帶質(zhì)粒、營(yíng)養(yǎng)缺陷等問(wèn)題，增加了生產(chǎn)的成本，無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。此外，現(xiàn)有菌株的構(gòu)建策略多局限在對(duì)限速反應(yīng)、分支途徑等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行改造，少有對(duì)肌苷代謝網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)優(yōu)化。針對(duì)這些問(wèn)題，本研究選擇大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株作為出發(fā)菌株，采用代謝工程技術(shù)，通過(guò)阻斷肌苷降解途徑、強(qiáng)化肌苷合成途徑、弱化腺苷合成支路、增強(qiáng)前體物供應(yīng)及修飾肌苷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，獲得了一株無(wú)質(zhì)粒、非缺陷型且可穩(wěn)定生產(chǎn)的肌苷工程菌株。

圖1 肌苷生物合成途徑和本研究的改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of inosine and the strategies used in this study注：*表示突變體

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

表1列舉了本研究所用到的菌株及質(zhì)粒。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

引物，GENEWIZ公司；Primer STAR HS DNA、ExtaqDNA Polymerase，TaKaRa公司；2×RapidTaqMix、ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit，Vazyme公司；Plasmid Mini Kit I D6943、Gel & PCR Clean Up Kit D2000、Cycle Pure Kit D6492，Omega Bio-Tek公司。

1.2 引物

具體內(nèi)容見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220509.1719.012.html)。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，NaCl 5，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，KH2PO4·3H2O 1.2，蛋白胨3，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各0.001。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉4，蛋白胨5，檸檬酸鈉2，KH2PO4·3H2O 2，MgSO4·7H2O 2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12和維生素H各0.002。

在INO2-4基礎(chǔ)上改造的菌株，培養(yǎng)基中均增添0.3 g/L腺嘌呤。

1.4 基因編輯方法

本研究采用CRISPR/Cas9基因編輯方法[7]對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因改造。該方法由pGRB質(zhì)粒、pREDCas9質(zhì)粒和DNA重組片段3個(gè)元件共同介導(dǎo)，即pGRB質(zhì)粒和DNA重組片段以電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入到含pREDCas9質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞中，pGRB質(zhì)粒表達(dá)出特異性gRNA來(lái)識(shí)別目的基因靶位點(diǎn)，pREDCas9質(zhì)粒表達(dá)出Cas9蛋白對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行切割，DNA重組片段通過(guò)同源重組的方式對(duì)切割位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)基因的準(zhǔn)確敲除與整合。具體步驟以整合pbuE基因?yàn)槔?/p>

使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)上同源臂引物yjiT-UP-S和yjiT-UP-A、插入片段引物pbuE-S和pbuE-A、下同源臂引物yjiT-DN-S和yjiT-DN-A。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得上同源臂yjiT-UP、插入片段Ptrc-pbuE、下同源臂yjiT-DN，純化回收后再經(jīng)PCR重疊獲得DNA重組片段yjiT∶∶Ptrc-pbuE。使用Cas-Designer工具設(shè)計(jì)yjiT假基因位點(diǎn)切割靶序列，獲得gRNA-yjiT-S和gRNA-yjiT-A兩條單鏈。將上述單鏈退火所得雙鏈片段與線性化載體進(jìn)行同源重組，再化轉(zhuǎn)至DH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子以獲得pGRB-yjiT質(zhì)粒。將重組片段yjiT∶∶Ptrc-pbuE和pGRB-yjiT質(zhì)粒同時(shí)電轉(zhuǎn)化至含pREDCas9質(zhì)粒的INO3-2感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并消除pGRB質(zhì)粒和pREDCas9質(zhì)粒，獲得重組菌株INO4-2。

1.5 發(fā)酵方法

1.5.1 搖瓶發(fā)酵

發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵周期為24 h，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加氨水維持pH值為7.0～7.2，初始葡萄糖耗盡后，補(bǔ)加600 g/L葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行。具體操作可參考文獻(xiàn)[8]。

1.5.2 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

發(fā)酵溫度為37 ℃,pH為7.0,溶氧(dissolved oxygen，DO)為25%～35%，接種量為20%，發(fā)酵周期為48 h。具體操作可參考文獻(xiàn)[8]。

1.6 檢測(cè)方法

采用高效液相色譜法方法[Thermo U3000，C18色譜柱，V(乙腈)∶V(0.5%三氟乙酸水溶液)=2∶98]對(duì)肌苷濃度進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置柱溫30 ℃，流速1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260，進(jìn)樣量20 μL。

殘?zhí)菨舛群蜕锪?OD600)測(cè)定參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌苷合成途徑的強(qiáng)化

強(qiáng)化合成途徑是促進(jìn)產(chǎn)物積累的常用策略之一。在之前的研究中，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)誘變篩選獲得了一株產(chǎn)鳥苷的解淀粉芽孢桿菌突變株TA208。測(cè)序結(jié)果表明[9]，該菌株的嘌呤操縱子已發(fā)生突變，推測(cè)有助于解除反饋調(diào)控，提升嘌呤從頭合成酶系的表達(dá)水平。本研究首先敲除了野生型大腸桿菌MG1655的rihA、rihB、rihC、deoD、ppnP基因，以阻斷肌苷的降解，構(gòu)建了底盤菌株INO1-1。為強(qiáng)化肌苷合成途徑，本研究將突變株TA208的嘌呤操縱子(purEKBCSQLGMNHD)整合在底盤菌株INO1-1的yghE假基因位點(diǎn)，由Ptrc啟動(dòng)子控制，構(gòu)建了菌株INO1-2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，INO1-2的肌苷產(chǎn)量達(dá)到155.2 mg/L。

PRPP和谷氨酰胺在PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶(amidophosphoribosyltransferase，PurF)催化下生成5-磷酸核糖胺和谷氨酸，是肌苷合成途徑的限速步驟，而PurF的催化活性受腺苷酸(adenosine monophosphate，AMP)和鳥苷酸(guanosine monophosphate，GMP)的協(xié)同反饋抑制[10]。據(jù)報(bào)道，大腸桿菌自身的PurF和枯草芽孢桿菌來(lái)源的PurF均可通過(guò)定點(diǎn)突變解除其所受反饋抑制[2,11]。于是，本研究將這兩種來(lái)源的突變基因purFecoK326Q,P410W和purFbsuD293V,K316Q,S400W分別整合至INO1-2的yeeP假基因位點(diǎn)，由Ptrc啟動(dòng)子控制，構(gòu)建了菌株INO1-3和INO1-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖2所示，INO1-4肌苷產(chǎn)量為308.3 mg/L，相比INO1-2提升98.6%；INO1-3肌苷產(chǎn)量為189.5 mg/L，相比INO1-2提升22.1%。結(jié)果表明，兩種PurF突變體的過(guò)表達(dá)均使肌苷產(chǎn)量得以提升，但突變體PurFbsuD293V,K316Q,S400W的效果更好，可顯著增強(qiáng)肌苷合成途徑通量，提升肌苷的產(chǎn)量。

圖2 增強(qiáng)肌苷合成途徑對(duì)肌苷發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of enhancing the expression of inosine synthesis pathway on inosine fermentation注：*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.2 腺苷合成支路的弱化

IMP到肌苷的分支途徑是肌苷合成途徑的重要組成部分，然而，IMP還存在另外兩條分支途徑，分別由腺苷酸合成酶(adenylosuccinate synthetase，PurA)和IMP脫氫酶(IMP dehydrogenase，GuaB)參與催化，向腺苷和鳥苷代謝。研究者對(duì)IMP分支代謝通量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)流向腺苷支路的碳代謝流遠(yuǎn)超流向肌苷和鳥苷支路的碳代謝流[3]，是限制肌苷合成的重要因素。因此，為提升肌苷支路代謝通量，同時(shí)探究阻斷腺苷或鳥苷支路對(duì)菌體生長(zhǎng)和生產(chǎn)的影響，本研究在INO1-4中分別單敲除與雙敲除了purA和guaB基因，依次構(gòu)建了菌株INO2-1、INO2-2和INO2-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，INO2-1、INO2-2和INO2-3的OD600值均下降至4.0左右，肌苷產(chǎn)量分別下降至75.2、33.7、98.1 mg/L。這表明腺苷和鳥苷支路的阻斷使細(xì)胞所需能量或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成受限，進(jìn)而嚴(yán)重影響到菌體生長(zhǎng)與生產(chǎn)。在培養(yǎng)基中添加0.3 g/L腺嘌呤和0.3 g/L鳥嘌呤后，3個(gè)菌株的OD600值和肌苷產(chǎn)量均顯著提升。其中INO2-1的肌苷產(chǎn)量為1 180.9 mg/L，OD600值為25.1；INO2-2肌苷產(chǎn)量為445.4 mg/L，OD600值為31.2；INO2-3的肌苷產(chǎn)量為778.8 mg/L，OD600值為17.7。這表明阻斷腺苷或鳥苷支路均可促進(jìn)肌苷積累，但腺苷支路的阻斷對(duì)肌苷產(chǎn)量的提升效果更加明顯；同時(shí)阻斷兩條支路代謝會(huì)使菌體內(nèi)代謝嚴(yán)重失衡，即使在添加缺陷物質(zhì)的條件下仍影響菌體生長(zhǎng)。另外，腺苷支路的阻斷使AMP從頭合成受阻，減弱了PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶所受反饋抑制，是肌苷產(chǎn)量提升的另一原因。

圖3 阻斷競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑對(duì)菌體生長(zhǎng)和肌苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of blocking competing metabolic pathways on growth and inosine fermentation

阻斷腺苷支路雖可顯著提升肌苷產(chǎn)量，但會(huì)嚴(yán)重影響菌株生長(zhǎng)。為平衡菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，適當(dāng)弱化而非直接阻斷腺苷支路是更加理性的選擇。研究表明，將枯草芽孢桿菌來(lái)源的PurA中第242位的脯氨酸替換為天冬酰胺，可降低53.7%的酶活力[5]。于是，本研究將INO1-4的purA基因替換為purAbsuP242N突變基因，構(gòu)建了菌株INO2-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，在無(wú)腺嘌呤添加的條件下，INO2-4的肌苷產(chǎn)量為810.2 mg/L，是INO2-1的10.8倍；OD600值為21.4，是INO2-1的5.4倍。在添加腺嘌呤的條件下，INO2-4的肌苷產(chǎn)量達(dá)到1 412.5 mg/L，相比INO2-1提升了19.6%；OD600值為30.3，相比INO2-1提升了20.7%。結(jié)果表明，突變體PurAbsuP242N的替換既可維持菌株一定的生長(zhǎng)水平，又能保證足夠的肌苷支路通量，進(jìn)而使肌苷產(chǎn)量和菌體OD600值均顯著提升。另外，添加腺嘌呤可使產(chǎn)量和生長(zhǎng)提升至更高的水平。

圖4 弱化腺苷合成支路對(duì)菌體生長(zhǎng)和肌苷發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of weakening Adenosine synthesis branch on growth and inosine fermentation

2.3 增強(qiáng)前體物PRPP的供應(yīng)

增強(qiáng)前體物的供應(yīng)有利于將代謝流持續(xù)導(dǎo)入目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑，促進(jìn)產(chǎn)物的積累。PRPP是嘌呤合成的重要前體物，其合成酶編碼基因prs的表達(dá)受到嘌呤阻遏物(DNA-binding transcriptional repressor，PurR)的反饋?zhàn)瓒鬧12]，同時(shí)Prs的催化活性受到腺苷二磷酸(adenosine-5′-diphosphate，ADP)和鳥苷二磷酸(guanosine-5′-diphosphate，GDP)的反饋抑制[10]。為解除反饋調(diào)控，本研究首先敲除了INO2-4的purR基因，構(gòu)建了菌株INO3-1。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，INO3-1的肌苷產(chǎn)量為1.6 g/L，與INO2-4相比提升了14.3%，OD600值沒(méi)有明顯變化。據(jù)報(bào)道，在大腸桿菌的Prs中引入D128A位點(diǎn)突變[2]和在解淀粉芽孢桿菌的Prs中引入N120S和L135I位點(diǎn)突變[13]，均可解除PRPP合酶所受反饋抑制。因此，本研究在INO3-1中的gapC位點(diǎn)分別整合了prsecoD128A與prsbazN120S,L135I突變基因，由Ptrc啟動(dòng)子控制，構(gòu)建了菌株INO3-2和INO3-3。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，INO3-2的肌苷產(chǎn)量達(dá)到3.1 g/L，與INO3-1相比提升了93.8%，而INO3-3的肌苷產(chǎn)量沒(méi)有提升。這表明突變體PrsecoD128A的過(guò)表達(dá)有效增強(qiáng)了PRPP的供應(yīng)，進(jìn)而提升了肌苷的產(chǎn)量。

2.4 肌苷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造

產(chǎn)物在胞內(nèi)積累過(guò)多會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)代謝負(fù)擔(dān)，也會(huì)引起產(chǎn)物介導(dǎo)的反饋抑制，需要及時(shí)排到胞外。為促進(jìn)肌苷外排，本研究在INO3-2的yjiT位點(diǎn)整合了大腸桿菌來(lái)源的nepI基因[14]和解淀粉芽孢桿菌來(lái)源的pbuE基因[15]，由Ptrc啟動(dòng)子控制，構(gòu)建了菌株INO4-1和INO4-2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，INO4-2的肌苷產(chǎn)量為3.9 g/L，相比INO3-2提升了25.8%；OD600值為35.2，相比INO3-2提升了16.7%；INO4-1的肌苷產(chǎn)量和OD600值均無(wú)明顯提升。這表明異源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的引入有效提升了菌體對(duì)肌苷的外排能力，同時(shí)緩解細(xì)胞內(nèi)代謝負(fù)擔(dān)，促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)。為進(jìn)一步提升肌苷產(chǎn)量，本研究在INO4-2的ilvG及ylbE位點(diǎn)分別整合了pbuE基因的雙拷貝及三拷貝，由Ptrc啟動(dòng)子控制，構(gòu)建了菌株INO4-3與INO4-4。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，INO4-3的肌苷產(chǎn)量為4.5 g/L，相比INO4-2提升了15.4%；INO4-4的肌苷產(chǎn)量沒(méi)有提升。這表明兩個(gè)拷貝的pbuE基因已最大化菌體對(duì)肌苷的外排能力。另外，nupC[16]、nupG[16]、ydhC[17]和xapB[16]基因也編碼肌苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將肌苷從胞外攝取到胞內(nèi)。于是本研究分別敲除了INO4-3的nupC、nupG、ydhC和xapB基因，構(gòu)建了菌株INO4-5、INO4-6、INO4-7與INO4-8。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6所示，INO4-5的肌苷產(chǎn)量為5.0 g/L，與INO4-3相比提升了11.1%，其余菌株的肌苷產(chǎn)量均沒(méi)有提升。這表明nupC基因所編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是參與肌苷攝取的主要透性酶，敲除該基因可減弱菌體對(duì)肌苷的吸收。

圖5 增強(qiáng)PRPP供應(yīng)對(duì)肌苷發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of enhancing the supply of PRPP on inosine fermentation

2.5 工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵測(cè)試

為測(cè)試菌株INO4-5的發(fā)酵性能，本研究5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度低于2 g/L時(shí)，開始流加800 g/L的葡萄糖。發(fā)酵結(jié)果如圖7所示，菌株在發(fā)酵初期生長(zhǎng)緩慢，20 h后OD600值達(dá)到最高并進(jìn)入穩(wěn)定期。0～12 h，肌苷合成速率較慢；12～32 h，肌苷保持了較高的合成速率。48 h 時(shí)肌苷的最終產(chǎn)量為20.2 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.12 g/g葡萄糖，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.42 g/(L·h)。

圖6 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造對(duì)肌苷發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of transport system modification on inosine fermentation

圖7 工程菌INO4-5的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果Fig.7 Fermentation results of the engineered strain INO4-5 in a 5 L bioreactor

3 討論

近年來(lái)，隨著抗病毒和抗腫瘤藥物需求量的增加，嘌呤核苷及其衍生物受到廣泛關(guān)注。然而，由于代謝途徑冗長(zhǎng)、代謝調(diào)控復(fù)雜以及多種前體物需求，肌苷合成十分困難。芽孢桿菌因具有較強(qiáng)的PPP途徑和嘌呤合成途徑通量，以及較弱的核苷磷酸化酶活力，是肌苷生產(chǎn)菌株選育中常見的底盤菌株。相比芽孢桿菌，大腸桿菌基因操作高效、發(fā)酵控制簡(jiǎn)便、生產(chǎn)周期較短，是發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷另一個(gè)優(yōu)良的宿主。于是，本研究將Ptrc啟動(dòng)子控制下的芽孢桿菌嘌呤操縱子引入大腸桿菌，不僅繞過(guò)了PurR介導(dǎo)的反饋?zhàn)瓒魴C(jī)制、鳥嘌呤介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制[18]，而且通過(guò)借助異源優(yōu)勢(shì)，提高了嘌呤從頭合成酶系的表達(dá)水平。隨著各模塊的優(yōu)化組合，肌苷產(chǎn)量持續(xù)提高，進(jìn)一步體現(xiàn)了引入芽孢桿菌嘌呤操縱子的重要作用。

腺苷和鳥苷支路對(duì)碳代謝流的分流也是肌苷合成的重要限制因素。本研究對(duì)比了阻斷這兩條支路對(duì)肌苷產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)腺苷支路的阻斷對(duì)肌苷產(chǎn)量提升效果更加明顯，但會(huì)導(dǎo)致菌體營(yíng)養(yǎng)缺陷。為平衡菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，本研究嘗試了兩種方式來(lái)改造腺苷支路。一方面是靜態(tài)弱化。本研究通過(guò)將自身PurA替換為低酶活力的PurAbsuP242N突變體的方式來(lái)弱化腺苷支路，相比于直接阻斷的方式，菌體生長(zhǎng)水平和肌苷產(chǎn)量均大幅提升。為進(jìn)一步提升菌株發(fā)酵性能，本研究嘗試拷貝了第二個(gè)purAbsuP242N基因。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，菌體OD600值達(dá)到70，而肌苷產(chǎn)量大幅降低，表明二拷貝purAbsuP242N基因使腺苷支路分流過(guò)強(qiáng)，不利于肌苷合成。后期應(yīng)嘗試其他表達(dá)強(qiáng)度，或開發(fā)新的活性位點(diǎn)突變，使PurA的表達(dá)更加均衡，同步提升菌體生長(zhǎng)水平和肌苷產(chǎn)量。另一方面是動(dòng)態(tài)調(diào)控。本研究選擇引入群體感應(yīng)系統(tǒng)[19]，通過(guò)響應(yīng)菌體密度來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)控purA基因的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)酵結(jié)果顯示，在生長(zhǎng)初期，菌體OD600值相比對(duì)照菌株INO1-4偏低；12 h后，菌體OD600值與對(duì)照菌株INO1-4幾乎保持一致；24 h搖瓶發(fā)酵后，肌苷產(chǎn)量?jī)H為0.3 g/L。推測(cè)purA基因轉(zhuǎn)錄停止后，胞內(nèi)已表達(dá)的PurA持續(xù)催化腺苷支路，導(dǎo)致肌苷支路通量不足。后期應(yīng)嘗試在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白水平的調(diào)節(jié)，如引入TEVp[20]、SsrA[21]等元件適時(shí)降解PurA，使動(dòng)態(tài)調(diào)控更加嚴(yán)謹(jǐn)和高效，真正實(shí)現(xiàn)“生長(zhǎng)模式”到“生產(chǎn)模式”的自動(dòng)切換。

PRPP是嘌呤從頭合成過(guò)程中的重要前體物。本研究通過(guò)敲除purR基因、過(guò)表達(dá)prsecoD128A基因，增強(qiáng)了PRPP的供應(yīng)，顯著提升了肌苷的產(chǎn)量。由于PRPP的前體物5-磷酸核糖經(jīng)PPP途徑生成，為持續(xù)提升菌株發(fā)酵性能，需對(duì)PPP途徑進(jìn)行改造。為此，本研究過(guò)表達(dá)了PPP途徑的關(guān)鍵酶編碼基因gnd和zwf，發(fā)酵結(jié)果顯示，肌苷的產(chǎn)量并沒(méi)有提高，而菌體OD600值略有下降。我們推測(cè)PPP途徑的強(qiáng)化，使胞內(nèi)還原力NADPH水平提升，反饋抑制了關(guān)鍵酶6-磷酸葡糖酸脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的酶活力，進(jìn)而限制了PPP碳通量的增強(qiáng)；胞內(nèi)NADPH/NADP+的比例失衡，可能是影響菌體生長(zhǎng)的原因。因此，開發(fā)解除反饋抑制的關(guān)鍵酶活性位點(diǎn)突變，同時(shí)增強(qiáng)NADPH的代謝以平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平，是進(jìn)一步提升肌苷產(chǎn)量的潛在策略。此外，減弱競(jìng)爭(zhēng)途徑也是提升PPP途徑通量的關(guān)鍵考慮。糖酵解途徑(embden-meyerhof-parnas，EMP)是PPP的主要競(jìng)爭(zhēng)途徑。WU等[22]通過(guò)敲除pgi基因來(lái)完全阻斷EMP途徑，經(jīng)52 h發(fā)酵，組氨酸產(chǎn)量與對(duì)照菌株相同，而菌體OD600值大幅下降，糖耗也顯著降低。這表明通過(guò)減弱EMP途徑來(lái)增強(qiáng)PPP途徑通量的方式，可顯著提升以PRPP為前體物的產(chǎn)物的糖酸轉(zhuǎn)化率。但對(duì)于EMP途徑與PPP途徑通量的再分配，應(yīng)側(cè)重于更加溫和可控方式，如通過(guò)起始密碼子替換或動(dòng)態(tài)調(diào)控等方式來(lái)減弱EMP途徑，才能達(dá)到同步提升產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的目的。同樣地，減弱2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸途徑[23]與PPP途徑的非氧化分支[24]，也有助于降低碳代謝流損失，促使更多碳代謝流流向肌苷合成途徑，提升肌苷的產(chǎn)量。