葉庭路，陳辦成，于波，楊虹，姜彬，邵勇，黃國新

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518036；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科，深圳 518036；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，汕頭 515041

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，U.urealyticum)是一種重要的病原微生物。近年來，其耐藥形勢十分嚴(yán)峻，尤其是對喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類[1-2]耐藥。從懷孕患者中分離的解脲脲原體及合并人型支原體(Mycoplasmahominis)感染的解脲脲原體耐藥形勢更嚴(yán)重[3]。其耐藥主要與抗生素的不合理應(yīng)用有關(guān)，這種情況如果得不到有效遏制，耐藥形勢必將更嚴(yán)峻。因此，尋找一種全新的有效替代治療方案尤為重要。

光動力抗微生物化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)是一種以光敏劑、光及氧分子相互作用為基礎(chǔ)的新型抗感染方法。文獻(xiàn)報道 PACT對病毒、細(xì)菌、真菌及寄生蟲有抑制或滅活作用，但對解脲脲原體的體外活性是否有影響目前尚不清楚。本研究擬探討以甲苯胺藍(lán)(toluidine blue)為光敏劑的PACT對解脲脲原體的體外滅活作用，為其新型治療方法的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象Uu-1(ATCC 27813，屬Parvo生物群)和Uu-5(ATCC 27817，屬T960生物群)兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科轉(zhuǎn)贈。解脲脲原體臨床株于2014年8月收集于北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚性病科門診，菌株1(Uu-c1)經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分群確定為Parvo生物群，菌株2(Uu-c2)經(jīng)PCR分群確定為T960生物群，均來自臨床表現(xiàn)典型的男性尿道炎患者尿道拭子標(biāo)本。

1.1.2主要試劑與設(shè)備解脲脲原體液體培養(yǎng)基購于珠海麗珠試劑股份有限公司，固體鑒定培養(yǎng)基購于廣州市怡林園生物工程有限公司。甲苯胺藍(lán)購于美國Sigma公司，以去離子水配制成25 mmol/L的儲存液，實驗前用支原體液體培養(yǎng)基稀釋成 5 mmol/L 的工作液。DNA分群鑒定引物為：上游5′-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3′，下游5′-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAAT-TC-3′，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)試劑盒及DNA marker購自天根生化科技(北京)有限公司，瓊脂糖購自廣州威佳科技有限公司。光源為武漢亞格光電技術(shù)有限公司的LED-IB光動力治療儀，波長(633±10)nm，最大功率密度100 mW/cm2。LRH-70F生化培養(yǎng)箱購于上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1解脲脲原體的純化、鑒定及密度測定解脲脲原體臨床株收集后，培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基，24 h內(nèi)待培養(yǎng)基顏色由黃色轉(zhuǎn)為淡紅色(仍保持澄清，不渾濁)，轉(zhuǎn)種于固體鑒定培養(yǎng)基純化，待出現(xiàn)典型棕黑色海膽狀細(xì)小菌落，挑取單個典型菌落轉(zhuǎn)種于液體培養(yǎng)基增菌，以保證菌株的純度。另取一份標(biāo)本行PCR鑒定及分群，具體操作參照本課題組以前的報道[4-5]。解脲脲原體臨床株及標(biāo)準(zhǔn)株均采用顏色改變單位(color change unit，CCU)法測定菌液密度，于96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板進(jìn)行，具體操作見參考文獻(xiàn)[6]。將菌液增菌或稀釋至CCU為104～105，于-70 ℃保存以備用。

1.2.2解脲脲原體與光敏劑孵育菌株的孵育于96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板(12行標(biāo)記為1～12，8列標(biāo)記為A～H，詳見圖1)中進(jìn)行。首先將液體培養(yǎng)基加入預(yù)先準(zhǔn)備好的96孔酶標(biāo)板第1、3、5、7、10行的第1～8孔，每孔90 μL。從第2孔起，每孔加入90 μL 5 mmol/L 甲苯胺藍(lán)工作液，充分均勻后吸取90 μL至第3孔，均勻后再從第3孔吸取90 μL至第4孔，如此進(jìn)行倍比稀釋，依次形成2.5～0.039 062 5 mmol/L的甲苯胺藍(lán)溶液。每行第1孔(A列)不加任何光敏劑，作為光敏劑空白對照。將保存的密度為104～105的解脲脲原體菌液復(fù)蘇，于第1、3、5、7行每孔分別加入菌株Uu-1、Uu-5、Uu-c1、Uu-c2各10 μL。第10行光照前不加菌株，光照后再加入菌株作為非光照對照組(見下述)。蓋好酶標(biāo)板蓋后，置于37 ℃生化箱中避光孵育。按孵育時間分兩組，分別為30、60 min(圖1)。每株菌株均操作3個96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，取均值。

圖1實驗操作示意圖
Fig.1Diagramofexperimentoperation

1.2.3光照孵育后，將酶標(biāo)板置于黑房中進(jìn)行光照。光源波長633 nm，能量功率密度均為100 mW/cm2，照射時間分別為8、17、34和68 min，故總能量密度分別為48、102、204和408 mJ/cm2。保證光源垂直照射，光源距離酶標(biāo)板20 cm。

1.2.4再培養(yǎng)光照后，在原酶標(biāo)板第2、4、6、8行每孔分別加入解脲脲原體液體培養(yǎng)基90 μL。將第1、3、5、7行每孔內(nèi)解脲脲原體菌液各吸取10 μL，分別轉(zhuǎn)種至第2、4、6、8行對應(yīng)孔內(nèi)。第10行每孔在光照后加入10 μL解脲脲原體菌株(Uu-1、Uu-5、Uu-c1或Uu-c2，每張酶標(biāo)板只加1種)。加樣完成后，每孔均滴加1滴無菌石蠟油覆蓋以避免培養(yǎng)基揮發(fā)。第10行菌株孵育20 min或60 min后，按上述方法轉(zhuǎn)種于第11行(圖1)。另在第12行加入與第2、4、6、8行內(nèi)含相同濃度甲苯胺藍(lán)的支原體培養(yǎng)基，作為判讀結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)顏色參照。接種完成后，將酶標(biāo)板置于生化培養(yǎng)箱同樣環(huán)境中進(jìn)行再培養(yǎng)。

1.2.5結(jié)果判讀孵育48 h后觀察并判讀結(jié)果。相對于第12行的標(biāo)準(zhǔn)顏色參照，孔內(nèi)液體顏色明顯變深，提示解脲脲原體生長，判讀為解脲脲原體陽性(圖2)。

圖2結(jié)果示意圖
Fig.2Diagramofexperimentresults

2 結(jié)果

2.1 PACT中甲苯胺藍(lán)濃度對解脲脲原體活性的影響

每塊酶標(biāo)板第10、11孔的對照組顯示，接種的Uu-1、Uu-5、Uu-c1或Uu-c2菌株在每孔中均能良好生長。但與不加光敏劑的A列相比，甲苯胺藍(lán)≥0.312 5 mmol/L的孔較更低濃度或不加甲苯胺藍(lán)的孔出現(xiàn)顏色變化要晚6～12 h。在光照能量密度及解脲脲原體與甲苯胺藍(lán)孵育時間固定的前提下，PACT對解脲脲原體的滅活作用隨甲苯胺藍(lán)濃度的增加而增強(qiáng)，即呈甲苯胺藍(lán)濃度依賴的模式(表1)。

2.2 PACT中光照能量密度對解脲脲原體活性的影響

在無光敏劑時，以不同能量照射解脲脲原體，4種能量密度下所有菌株均能生長，且生長速度與非光照且不加甲苯胺藍(lán)的解脲脲原體相當(dāng)，提示本研究所用的633 nm紅光光源在408 J/cm2及以下的能量密度對解脲脲原體的活性無明顯影響。在甲苯胺藍(lán)濃度及其與解脲脲原體孵育時間固定的條件下，PACT對解脲脲原體的滅活作用隨光照能量密度的增加而增強(qiáng)，即呈光照能量密度依賴的模式(表1)。

表1PACT處理后解脲脲原體仍可生長的甲苯胺藍(lán)最高濃度
Tab.1ThemaximumtoluidineblueconcentrationofU.urealyticumsurvivalafterPACTtreatment(mmol/L)

StainIncubationtime(min)Iradiationfluence(J/cm2)048102204408Uu?130≥2．5≥2．51．250．31250．039062560≥2．5≥2．50．6250．15625<0．0390625Uu?530≥2．5≥2．5≥2．50．31250．1562560≥2．51．251．250．156250．078125Uu?c130≥2．5≥2．51．250．156250．1562560≥2．5≥2．50．6250．156250．078125Uu?c230≥2．5≥2．51．250．156250．1562560≥2．5≥2．50．6250．0781250．078125

2.3 PACT中光敏劑孵育時間對解脲脲原體活性的影響

本研究采用兩個光敏劑孵育時間，以比較孵育時間對PACT作用的影響。由表1可見，總的趨勢是隨光敏劑孵育時間延長，PACT對解脲脲原體的滅活作用有增強(qiáng)趨勢。

2.4 不同解脲脲原體生物群對PACT敏感性的差異

選用兩種解脲脲原體生物群各兩株菌株(包括標(biāo)準(zhǔn)株及臨床分離株)，由表1可見，兩種生物群之間標(biāo)準(zhǔn)株與臨床株對PACT的敏感性相似。

3 討論

病原微生物耐藥的廣泛蔓延促進(jìn)了大量抗微生物感染的研究，但至今缺乏安全、有效的治療方法。PACT是一種結(jié)合光敏劑分子和可見光照射產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物，對病原微生物進(jìn)行滅活的抗微生物方法。近年來，隨著光敏劑及激光技術(shù)的發(fā)展，PACT抗耐藥微生物感染的治療研究得到廣泛關(guān)注。體外和動物研究表明，PACT已成功用于革蘭陽性及革蘭陰性菌[7-8]、病毒[9]、真菌[10]、寄生蟲[11-12]感染的治療，至今尚無文獻(xiàn)報道微生物對PACT治療的耐受性。因此，PACT有望成為微生物感染領(lǐng)域中頗有前景的替代治療方法。

目前尚無PACT對解脲脲原體活性影響的報道，本研究首次嘗試在體外探討甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的PACT對解脲脲原體的滅活作用。甲苯胺藍(lán)是一種常用的PACT光敏劑，較常應(yīng)用于PACT的研究。甲苯胺藍(lán)在常規(guī)劑量下對細(xì)菌等無明顯滅活作用，但在合適光源存在時能有效抑制革蘭陽性及革蘭陰性細(xì)菌生長[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲苯胺藍(lán)在2.5 mmol/L時對解脲脲原體生長有一定抑制，但無完全滅活作用。在有光照時，PACT對解脲脲原體的滅活作用呈甲苯胺藍(lán)濃度依賴模式。同樣，633 nm紅光光源在408 J/cm2及以下能量密度時對解脲脲原體生長活性基本無影響，但在甲苯胺藍(lán)存在時對解脲脲原體的滅活作用呈光照能量密度依賴模式。此外，延長解脲脲原體與甲苯胺藍(lán)孵育時間在一定程度上也增強(qiáng)了PACT對解脲脲原體的滅活效果，與PACT對白假絲酵母(又稱白念珠菌)的效果類似[14]，提示PACT有望成為解脲脲原體感染的有效替代治療方法。但PACT對耐藥解脲脲原體是否也具有滅活作用，或是否能增加耐藥解脲脲原體對藥物的敏感性，需進(jìn)一步深入研究。

PACT殺滅解脲脲原體的機(jī)制尚不清楚。Rosseti等[14]研究發(fā)現(xiàn)，甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的PACT對白念珠菌生物膜的形成有顯著抑制作用，且這種作用與真菌細(xì)胞在光照后于培養(yǎng)基中的孵育時間有關(guān)，時間越長則抑制效果越明顯。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，這種作用與PACT增加真菌細(xì)胞壁通透性及培養(yǎng)基內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)有關(guān)。與此類似，PACT對革蘭陽性及革蘭陰性細(xì)菌的殺滅作用有賴于三線態(tài)光子和ROS的產(chǎn)生，通過Ⅰ型機(jī)制及Ⅱ型機(jī)制殺滅病原體[15]。形態(tài)學(xué)上，解脲脲原體沒有細(xì)胞壁，只有一種3層結(jié)構(gòu)的單位膜，更接近革蘭陰性細(xì)菌。甲苯胺藍(lán)介導(dǎo)的PACT也可能通過類似作用滅活解脲脲原體，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。

解脲脲原體有兩種生物群，兩群之間致病性可能存在差異[16-17]。本研究使用解脲脲原體兩種生物群的臨床株及標(biāo)準(zhǔn)株，探討它們對PACT反應(yīng)性的差異。初步結(jié)果顯示，解脲脲原體兩種生物群對PACT的反應(yīng)性相似，但滅活作用是否存在差異需更大樣本研究。

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