田苗苗，張優(yōu)儀，王小蓮，鐘江，李瑞

1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系，上海 200438；2.河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，張掖 734000

百日咳是傳染性強(qiáng)、感染率高的急性呼吸道傳染病，嬰幼兒是其易感人群。在小于1歲的嬰兒中，肺炎、百日咳腦病和營(yíng)養(yǎng)不良是百日咳所致死亡的主要原因。百日咳鮑特菌(Bordetellapertussis，B.pertussis)是引起百日咳的最主要病原菌。隨著免疫接種等有效措施的推廣，百日咳的發(fā)病得到有效控制。但近年來(lái)，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)疾病監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期疫苗接種所帶來(lái)的百日咳低發(fā)病率形勢(shì)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為發(fā)達(dá)國(guó)家百日咳發(fā)病率復(fù)升和發(fā)展中國(guó)家屢屢出現(xiàn)百日咳暴發(fā)，即所謂“百日咳重現(xiàn)”(pertussis resurgence)[1-3]。造成百日咳重現(xiàn)的原因，除疫情報(bào)告的敏感性提高外，還有對(duì)該病的重視程度及監(jiān)測(cè)力度不夠[4]，最重要的是目前廣泛使用的百日咳疫苗免疫成功率低導(dǎo)致免疫人群中百日咳抗體水平逐年降低，以及耐藥突變菌株的出現(xiàn)[5]。

百日咳鮑特菌通過(guò)產(chǎn)生多種毒力因子定植于上呼吸道而進(jìn)行感染。主要毒力因子包括百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)、絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA)、百日咳桿菌黏附素(pertactin，PRN)、皮膚壞死毒素(dermonecrotic toxin，DNT)、腺苷酸環(huán)化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT)、氣管細(xì)胞毒素(tracheal cytotoxin，TCT)等。其中PTX是百日咳感染過(guò)程中的重要毒力因子，其全毒素幾乎可結(jié)合任何含唾液酸的糖蛋白，其異三聚體G蛋白的ADP-核糖基化能影響多種不同類型細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[6]。PTX由S1、S2、S3、S4和S5共5種亞基構(gòu)成，其中 S1 具有酶活性，負(fù)責(zé)結(jié)合靶細(xì)胞受體，也是免疫原性最強(qiáng)的抗原成分[7-8]。DNT在百日咳鮑特菌中的作用不確定，但在支氣管炎鮑特菌(Bordetellabronchiseptica)中已被鑒定為重要毒素，且在微量注射時(shí)顯示出致死活性[9]。TCT是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁肽聚糖分解產(chǎn)物[10]，在其他物質(zhì)的協(xié)同下誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，破壞宿主氣管纖毛細(xì)胞[11-13]，從而出現(xiàn)咳嗽癥狀。TCT通常由 ampG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白重新運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞壁生物合成過(guò)程中被重新利用。與多數(shù)革蘭陰性菌如大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)相比，百日咳鮑特菌的ampG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白效率非常低[9]。

已有研究報(bào)道成功構(gòu)建了減毒百日咳活疫苗株。其中Locht團(tuán)隊(duì)于2006年成功構(gòu)建BPZE1[9]，目前已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)(ClinicalTrials.gov，NCT01188512)。在該菌株中，dnt和tct基因被敲除，并采用編碼無(wú)酶活性的ptx突變體替換天然ptx基因，即將具有酶活性的S1亞基中參與底物結(jié)合和催化的關(guān)鍵殘基Arg-9換成Lys，Glu-129換成Gly[9]，從而降低其致病性。

本研究將百日咳鮑特菌的重要毒力因子PTX、DNT、TCT全部敲除，以期獲得一種安全性更高、致病性更低的新型減毒百日咳鮑特菌BPTM1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BPTM1具有極佳的體外生長(zhǎng)曲線和體內(nèi)肺部定植能力，感染小鼠后并未引起明顯的肺部病理炎癥，且能誘導(dǎo)與野生型菌株同樣的免疫反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒百日咳鮑特菌18323(ATCC#B.pertussisstrain 18323)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供。本實(shí)驗(yàn)使用的百日咳鮑特菌是百日咳鮑特菌18323鏈霉素抗性菌株，命名為BPMM。E.coliDH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pUC19購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，慶大霉素抗性的自殺性質(zhì)粒pJQ200mp18-rpsl由新加坡國(guó)立大學(xué)贈(zèng)送。

1.1.2引物根據(jù)百日咳鮑特菌18323基因組序列(http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/bordetella.html)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，所有引物合成、測(cè)序、鑒定均委托鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成，序列見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1百日咳鮑特菌培養(yǎng)將百日咳鮑特菌BPMM置于含20%無(wú)菌脫纖維羊血(sterile defidrinated sheep blood)和100 μg/mL鏈霉素的Bordet-Gengou瓊脂血平板上，于37 ℃生長(zhǎng)4 d[14]。為獲得液體培養(yǎng)物和擴(kuò)大菌量，可將其接種至Stainer-Scholte培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.2.23個(gè)毒力基因(ptx、dnt、ampG)的敲除或置換首先，采用同源重組方法敲除ptx基因。以百日咳鮑特菌BPMM為模板，PCR擴(kuò)增獲得ptx基因N端(基因組位置3870259～3870746)、C端(3873824～3874156)同源臂，分別命名為pPCR1和pPCR2。在pPCR1兩端引入酶切位點(diǎn)SalⅠ和BamHⅠ；在pPCR2上游引入酶切位點(diǎn)SalⅠ，下游引入酶切位點(diǎn)HindⅢ和EcoRⅠ。然后，將pPCR1和pPCR2依次克隆至pUC19載體質(zhì)粒的相應(yīng)位置，pPCR1、pPCR2相鄰插入pUC19載體質(zhì)粒。應(yīng)用酶切位點(diǎn)HindⅢ，將pPCR1、pPCR2整體從pUC19中切下并連接至質(zhì)粒pJQ200mp18-rpsl中，獲得質(zhì)粒pJQ-PCR1/2。將質(zhì)粒pJQ-PCR1/2電轉(zhuǎn)入BPMM中，用血平板進(jìn)行篩選。pJQ-PCR1/2轉(zhuǎn)入BPMM后，質(zhì)粒上攜帶的片段pPCR1與BPMM中的同源PCR1自發(fā)進(jìn)行第1輪同源重組，此時(shí)pJQ插入BPMM，使BPMM攜帶慶大霉素抗性而失去鏈霉素抗性，在血平板上表現(xiàn)為菌株在慶大霉素血平板上生長(zhǎng)而不能在鏈霉素平板上生長(zhǎng)。在鏈霉素篩選壓力下，BPMM進(jìn)行第2輪同源重組，即質(zhì)粒上攜帶的片段pPCR2與BPMM中的同源pPCR2重組，pJQ200mp18-rpsl脫離BPMM基因組并降解，BPMM失去慶大霉素抗性，獲得鏈霉素抗性，在血平板上表現(xiàn)為菌株在鏈霉素平板上生長(zhǎng)而不能在慶大霉素血平板上生長(zhǎng)。

表1PCR引物序列
Tab.1SequencesofPCRprimers

GenePrimerSequence(5′→3′)ptxpPCR1?FACGCGTCGACTTCGTCGCCTCGCCCTGGTTpPCR1?RCGGGATCCGCGTTTCGGTGGTGCCTATpPCR2?FCGGGATCCTTCCAGACCTATGCCCTCACCpPCR2?RGGAATTCAAGCTTCGGAACAGCAGCTTGTAGCCPY?F1AAGGGAACCGACCCCAAGATAPY?R1ACTCGCACCACGTCCAGCACAdntdPCR1?FACGCGTCGACCGCACCGTAACCGTTGGTdPCR1?RCGGGATCCGCAATGCCGATTCATCTTTATdPCR2?FCGGGATCCTGATTTCCAACGACGGACAAGGdPCR2?RGGAATTCAAGCTTCCGAGGTGCTGACCAACGAGampG(B．pertussis)aPCR1?FACATGCATGCGGCGATTCCGTACAGCGTGACAaPCR1?RGCTCTAGACGCGCTGCCCGGGTTATGaPCR2?FCGGGATCCCGGCACGTAGCGGTCGATGAaPCR2?RGGAATTCAAGCTTTGCTGGTGCTGGGCTTTGCampG(E．coli)AmpG?FGCTCTAGAGCCCATGTCCAGTCAATATTTACGAmpG?RCGGGATCCCAGATTACGTCAGATGCGTTTTTC

The cutting sites of restriction endonucleases were in italic.

第2個(gè)毒力基因dnt的敲除原理和步驟與ptx相同。PCR獲得dnt的N端(3985341～3985517)、C端(3989759～3990089)同源臂，分別命名為dPCR1和dPCR2。

第3個(gè)基因ampG的置換采用E.coliDH5α的ampG基因替換野生型百日咳鮑特菌的ampG。簡(jiǎn)言之，構(gòu)建一個(gè)含有E.coliDH5αampG的自殺性質(zhì)粒，在E.coliDH5αampG5′端插入BPMMampG的上游片段(3509798～3510074)，命名為aPCR1；在E.coliDH5αampG3′端插入BPMMampG的下游片段(3511028～3511200)，命名為aPCR2。將自殺性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至百日咳鮑特菌中，通過(guò)兩次連續(xù)同源重組，在相應(yīng)培養(yǎng)基上獲得ampG置換的百日咳鮑特菌。

最后，通過(guò)PCR和測(cè)序來(lái)驗(yàn)證3種基因的敲除。

1.2.3蛋白免疫印跡法檢測(cè)采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)百日咳鮑特菌主要毒力因子PTX的表達(dá)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的百日咳鮑特菌液，5 000g離心 1 min，棄上清液，加入250 μL雙蒸水重懸菌體；再加入250 μL 2×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS) Loading Buffer，100 ℃ 煮10 min；用1 mL注射器針頭吸打數(shù)次切斷DNA，100 ℃ 再煮15 min，制成SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)樣品。一抗為兔多克隆Anti-Bordetellapertussistoxin抗體(Abcam公司)，稀釋度1∶2 000；二抗為堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(Anti-rabbit IgG)抗體(Sigma公司)，稀釋度1∶10 000。5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氯化硝基四氮唑藍(lán)(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitrotetrazolium blue chloride，BCIP/NBT)室溫下避光顯色5～15 min。

1.2.4動(dòng)物感染和百日咳鮑特菌定植曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠為5周齡無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雌性BALB/c小鼠(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。從鏈霉素抗性血平板上(37 ℃，4 d)刮下百日咳鮑特菌，懸浮于無(wú)菌、含5%吐溫80的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline with 5% Tween 80，PBST)中，混合均勻后測(cè)OD600值，換算成相應(yīng)的百日咳鮑特菌密度(1OD=2×108CFU/mL)。麻醉小鼠，用槍頭從小鼠兩側(cè)鼻腔緩緩滴入5×106CFU 百日咳鮑特菌，感染后 3 h、3 d、7 d、10 d、17 d取小鼠肺，放入裝有500 μL PBS和3個(gè)小磁珠的1.5 mL離心管中，用高通量組織破碎儀(上海萬(wàn)柏生物科技有限公司)研磨均勻(60 Hz，90 s)。用PBS按10倍梯度法稀釋至一定倍數(shù)后，取100 μL涂于鏈霉素抗性血平板上，37 ℃培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)。

1.2.5肺部病理實(shí)驗(yàn)5周齡實(shí)驗(yàn)小鼠每只接種20 μL 含1×106CFU的百日咳鮑特菌BPTM1或BPMM，對(duì)照組小鼠給予20 μL PBST。感染7 d后，取肺，浸泡于PBS配制的4%多聚甲醛溶液，固定1～2 d，包埋，切片，蘇木精-伊紅(haematoxylin-eosin，HE)染色并分析。

1.2.6體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)收集正常小鼠和百日咳鮑特菌感染小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)(3 h、3 d、7 d、10 d、17 d)的眼眶血，離心獲得抗血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)百日咳鮑特菌特異性IgG及其亞型IgG1和IgG2a。包被抗原的制備：百日咳鮑特菌液體培養(yǎng)物用PBS洗滌后進(jìn)行超聲破碎(190 W，4 s開(kāi)，6 s關(guān)，39個(gè)循環(huán))，4 ℃ 14 000g離心30 min，取上清液即得抗原液。用Nanodrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白總濃度。二抗為1∶10 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗IgG及其亞型IgG1和IgG2a ；底物為四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)。按抗原包被、洗板、封閉、洗板、加抗血清、洗板、加二抗、加底物、終止反應(yīng)等步驟進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀上讀取OD450值。當(dāng)OD值大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值2倍時(shí)，即為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 減毒百日咳鮑特菌BPTM1的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)利用同源重組方法敲除了百日咳鮑特菌BPMM的重要毒力因子PTX和DNT，同時(shí)置換了編碼負(fù)責(zé)TCT重吸收的ampG基因，降低了TCT的釋放。將獲得的減毒百日咳鮑特菌命名為BPTM1。以BPMM和BPTM1的全基因組DNA為模板，以ptx基因的上下游引物PY-F1、PY-R1進(jìn)行PCR，如圖1A所示，BPMM擴(kuò)增條帶大小為 3 892 bp，BPTM1擴(kuò)增條帶大小為814 bp。以dnt基因的上下游引物dPCR1-F、dPCR2-R進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)圖1B，BPMM擴(kuò)增條帶大小為4 749 bp，BPTM1擴(kuò)增條帶大小為508 bp。以百日咳鮑特菌ampGN端aPCR1-F為上游引物，E.coliAmpG-R為下游引物，BPMM擴(kuò)增未獲得條帶，BPTM1擴(kuò)增獲得條帶大小為1 761 bp。目的條帶大小均與預(yù)期一致，證明BPTM1的ptx和dnt基因被刪除，且ampG被替換成E.coliampG。以上結(jié)果表明，減毒百日咳鮑特菌BPTM1構(gòu)建成功。

在百日咳鮑特菌感染過(guò)程中，PTX是一個(gè)非常重要的毒力因子，其S1亞基毒力最強(qiáng)，相對(duì)分子質(zhì)量為 23 000左右。以BPTM1和BPMM菌體為抗原，以Anti-Bordetellapertussistoxin為一抗，Anti-rabbit IgG為 二抗，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)S1的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，BPTM1在相對(duì)分子質(zhì)量23 000左右未檢測(cè)到明顯條帶，表明BPTM1的毒素表達(dá)顯著降低。

2.2 BPTM1體外生長(zhǎng)和體內(nèi)定植能力與野生型相當(dāng)

PTX、DNT和TCT是百日咳鮑特菌的重要組成部分，敲除相關(guān)基因和減少釋放可能影響細(xì)菌的生長(zhǎng)能力。檢測(cè)BPTM1和BPMM的體外生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖3A所示，百日咳鮑特菌BPTM1與野生型BPMM的生長(zhǎng)能力幾乎一致。

圖1PCR鑒定減毒百日咳鮑特菌BPTM1
Fig.1IdentificationofattenuatedBordetellapertussisBPTM1byPCR

圖2蛋白免疫印跡法檢測(cè)PTX的表達(dá)
Fig.2PTXexpressionassayedbyWesternblotting

百日咳鮑特菌在體內(nèi)的定植效率關(guān)系著其體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。分別用BPTM1和BPMM感染小鼠，于3 h、3 d、7 d、10 d、17 d后取小鼠肺，研磨稀釋后涂于鏈霉素抗性血平板，37 ℃培養(yǎng)7 d，計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖3B所示，BPTM1在小鼠肺部的定植率幾乎與野生型菌株同樣高效。

圖3減毒百日咳鮑特菌BPTM1的體外和體內(nèi)生長(zhǎng)曲線
Fig.3GrowthcurvesofattenuatedBordetellapertussisBPTM1invitro(A)andinvivo(B)

2.3 BPTM1能明顯減輕肺部病理

實(shí)驗(yàn)組每只小鼠鼻腔感染 20 μL含1×106CFU BPTM1和BPMM的菌液，對(duì)照組小鼠通過(guò)鼻腔給予20 μL PBST。感染7 d后，取肺組織進(jìn)行HE染色分析。如圖4所示，野生型BPMM感染小鼠顯示出嚴(yán)重的肺損傷，肺血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，血管周圍水腫明顯，肺臟中肺泡廣泛遭到破壞，細(xì)胞破碎，肺間質(zhì)存在炎性細(xì)胞的強(qiáng)烈浸潤(rùn)。而減毒BPTM1感染小鼠肺臟中肺泡結(jié)構(gòu)正常，腔內(nèi)無(wú)滲出物，肺間質(zhì)幾乎無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與對(duì)照組小鼠肺結(jié)構(gòu)非常接近。結(jié)果表明，與野生型百日咳鮑特菌BPMM相比，減毒BPTM1感染小鼠的肺部病理明顯減輕。

圖4BPMM和BPTM1感染7d后小鼠肺組織病理分析
Fig.4HistologicalanalysisoflungsfromBPMM-orBPTM1-infectedmiceat7dpost-infection

2.4 BPTM1誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用

檢測(cè)BPMM與BPTM1感染小鼠7 d、10 d、17 d后血清中抗百日咳鮑特菌IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。結(jié)果顯示，感染7 d、10 d后，減毒株BPTM1誘導(dǎo)的3種抗體水平與野生型組無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。感染17 d后，BPTM1感染小鼠體內(nèi)百日咳鮑特菌特異性總IgG和IgG1水平與野生型組也幾乎無(wú)差異，但百日咳鮑特菌特異性IgG2a水平顯著高于野生型組(圖5)。

圖5BPMM和BPTM1感染17d后小鼠血清中各抗體水平
Fig.5AntibodylevelsinserumofBPMM-orBPTM1-infectedmiceat17dpost-infection

3 討論

百日咳一直被認(rèn)為是一種已得到有效控制的傳染病，但近年來(lái)百日咳疫情相繼在許多國(guó)家和地區(qū)重現(xiàn)，傳統(tǒng)的百日咳疫苗和接種方法并不如人們想象得那般完美。全細(xì)胞百日咳疫苗(whole cell pertussis vaccine，WPV)是最初使用的百日咳疫苗，但由于其頻頻出現(xiàn)不良反應(yīng)，不少國(guó)家已停止使用。無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine，APV)是被大多數(shù)國(guó)家“寄予厚望”的替代疫苗，在有些發(fā)達(dá)國(guó)家已全面使用，中國(guó)也在嘗試推廣中[15-16]。但APV效力低下，費(fèi)用高，不能有效阻斷百日咳傳播[17]，引入APV的國(guó)家產(chǎn)生大量突變株(缺失毒力因子PRN、PTX或FHA等)[18]，且出現(xiàn)百日咳重現(xiàn)和大暴發(fā)的比例高于使用WPV的國(guó)家。由于WPV和APV均存在明顯的缺陷，研發(fā)新的百日咳疫苗迫在眉睫。自然的百日咳感染能誘導(dǎo)強(qiáng)烈而持久的免疫保護(hù)作用[19]，因此可推測(cè)，預(yù)防百日咳感染的最好疫苗應(yīng)是百日咳減毒活疫苗。

BPZE1是目前較被廣泛認(rèn)可的百日咳減毒株[9]。其能保持高效定植于小鼠肺部的能力和誘導(dǎo)針對(duì)百日咳鮑特菌感染的免疫功能，感染動(dòng)物中肺部炎癥顯著減少。本研究獲得的減毒百日咳鮑特菌BPTM1，無(wú)論是在定植能力還是在減輕肺部炎癥程度上均可與BPZE1媲美。但遺憾的是，本研究未能獲得BPZE1菌株，不能進(jìn)行直觀比較；而研制BPTM1的初衷也包括獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的減毒百日咳鮑特菌。

本研究利用同源重組方法敲除了ptx和dnt，并用E.coliDH5αampG基因替換原有的ampG序列，成功構(gòu)建了一株減毒百日咳鮑特菌BPTM1。在DNA水平上用PCR技術(shù)驗(yàn)證了這3種基因的敲除或替換，且蛋白免疫印跡法檢測(cè)表明百日咳鮑特菌主要毒力因子PTX的S1亞基消失。體外生長(zhǎng)曲線和體內(nèi)定植曲線均表明，減毒百日咳鮑特菌BPTM1的生長(zhǎng)和定植能力沒(méi)有受影響，幾乎與野生型菌株同樣高效。相比于野生型菌株BPMM，BPTM1能在明顯減輕肺部病理的條件下誘導(dǎo)同樣高水平的百日咳鮑特菌特異性IgG和IgG1抗體，且BPTM1誘導(dǎo)的IgG2a抗體水平更高。

本研究敲除了整個(gè)ptx基因(3 000多bp)，結(jié)果表明，即使敲除整個(gè)ptx序列也未影響B(tài)PTM1的體內(nèi)定植。相比于只將有酶活性的基因進(jìn)行突變，敲除整個(gè)ptx基因?qū)⑹咕旮踩?，如果以后發(fā)展為人用疫苗也必然更安全、可控。有研究表明，PTX能提高轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)和白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)血清水平，促進(jìn)CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié) T 細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)產(chǎn)生[20]。Treg的增加會(huì)抑制免疫反應(yīng)，不利于疫苗發(fā)揮作用[21]。本研究觀察到，BPTM1誘導(dǎo)的百日咳鮑特菌特異性IgG2a水平顯著高于野生型組，這種現(xiàn)象在BPZE1中未見(jiàn)報(bào)道[7]。推測(cè)這是由于毒力因子PTX被刪除，Treg產(chǎn)生減少，從而導(dǎo)致免疫水平提高。

減毒百日咳鮑特菌BPTM1鼻腔接種方式也顯示了其明顯的優(yōu)越性，這種無(wú)針接種降低了感染的概率。BPTM1可通過(guò)培養(yǎng)大量獲取，成本低廉且工藝簡(jiǎn)單。此外，減毒百日咳鮑特菌有超出針對(duì)百日咳的其他附加價(jià)值和潛在作用——有可能被用作將異源抗原遞送至呼吸道的有效活疫苗和載體[22]，也可能提供對(duì)抗甲型流感病毒致死攻擊的交叉保護(hù)等[23]。將ptx完全敲除的BPTM1能更安全、更好地發(fā)揮其附加價(jià)值。

當(dāng)然，要想成為一株人用疫苗還有待開(kāi)展更多研究。ptx、dnt敲除勢(shì)必會(huì)影響保護(hù)性抗體的產(chǎn)生，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)BPTM1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫保護(hù)能力，并進(jìn)行保護(hù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作為疫苗的潛力，或?qū)PTM1行進(jìn)一步基因改造，探索構(gòu)建新型高效百日咳減毒疫苗的其他方法。目前，我國(guó)對(duì)減毒百日咳鮑特菌的研究非常少，而減毒微生物疫苗會(huì)在未來(lái)成為一種趨勢(shì)。BPTM1的研究為新型百日咳疫苗及其他疫苗的構(gòu)建提供了思路。

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