郭金剛 類承斌

【摘要】 目的：探討U0126對(duì)急性白血病細(xì)胞HL-60增殖與凋亡的影響。方法：用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細(xì)胞24、48、72 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)，EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、生存素（Survivin）、p21和p27表達(dá)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）磷酸化水平。

結(jié)果：5、10、20 μmol/L的U0126處理HL-60細(xì)胞24、48、72 h，能顯著提高細(xì)胞增殖抑制率（P<0.01），具有時(shí)間與劑量依賴性（r=0.421、0.478）。與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能使細(xì)胞核發(fā)白，致密濃染，細(xì)胞增殖率降低（P<0.01），細(xì)胞周期阻滯在G1期（P<0.01），PCNA、Survivin及p-ERK1/2表達(dá)均下調(diào)（P<0.01），p21與p27表達(dá)均上調(diào)（P<0.01）。結(jié)論：U0126能顯著抑制白血病細(xì)胞HL-60增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 U0126； 急性白血??； HL-60； 增殖； 凋亡

急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種源自造血干細(xì)胞惡性克隆的血液腫瘤，是急性白血病中的一種，約占80%。近年來(lái)隨著化療、放療、干細(xì)胞技術(shù)的不斷進(jìn)步，AML的治愈率大大提高，但患者的5年生存率仍不到50%[1-2]。因此進(jìn)一步探討AML的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療方法具有重要意義。AML的發(fā)生發(fā)展與眾多信號(hào)通路密切相關(guān)，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kanase，MAPKs）信號(hào)通路就是其中一種，此信號(hào)通過(guò)三級(jí)酶促反應(yīng)將上游信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，引起一連串生物反應(yīng)[3-4]。1，4-二氨基-2，3-氰基-1，4-雙[2-氨基苯基硫代]丁二烯（U0126）是該信號(hào)通路特異、高效的抑制劑，能夠通過(guò)抑制MEK活性，阻斷ERK的磷酸化及信號(hào)傳遞[3-4]。有研究顯示，MAPK信號(hào)通路成員在白血病中被高度激活，而U0126能顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、舌鱗癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[5-7]，但U0126在急性白血病中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究將探討U0126對(duì)急性白血病HL-60細(xì)胞增殖與凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 兔抗人PCNA、Survivin、p21、p27、GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司；兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；U0126、Hoechst染色試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南通碧云天生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒南京凱基生物技術(shù)有限公司；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。DMI4000B倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)萊卡公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀、DYCZ-25D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)thermo公司。

1.2 細(xì)胞株 人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)候以1︰3的比例傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測(cè)HL-60細(xì)胞活力 將5×103個(gè)HL-60細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細(xì)胞24、48、72 h，加入20 μL的MTT孵育4 h，將96孔板中翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)?xiàng)壢ド锨逡?，再每孔加?50 μL的二甲基亞砜，于微量振蕩器震蕩使結(jié)晶物溶解，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)560 nm處測(cè)OD值，細(xì)胞增殖抑制率（%）=（U0126組OD值-空白組OD值）/（control組OD值-空白組OD值×100%。

1.3.2 Hoechst染色檢測(cè)HL-60細(xì)胞形態(tài) 將8×103個(gè)HL-60細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細(xì)胞48 h，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，加入終濃度為10 μg/mL的Hoechst染色液，染色5 min，PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡的細(xì)胞熒光更強(qiáng)，細(xì)胞核發(fā)白，呈現(xiàn)皺染。

1.3.3 EdU染色檢測(cè)HL-60細(xì)胞增殖情況 將5×103個(gè)HL-60細(xì)胞接種到96孔板，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細(xì)胞48 h，每孔加入終濃度為50 μM的EdU染液并孵育2 h，PBS洗滌3次；接著加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，接著加入50 μL濃度為2 mg/mL的甘氨酸搖床孵育5 min，同時(shí)也可以加入100 μL的0.5%的TritonX-100進(jìn)行滲透加強(qiáng)，PBS洗滌3次。緊接著每孔加入100 μL的1×Apollo染色液于室溫避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次。每孔繼續(xù)加入100 μL的Hoechst33342染色液，于室溫避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次。最后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU染色呈現(xiàn)紅光，Hoechst染色呈現(xiàn)藍(lán)光。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將8×103個(gè)HL-60細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細(xì)胞48 h，每組細(xì)胞首先收集1×105/mL個(gè)細(xì)胞，再加入5 μL的Rnase，吹打混勻后，37 ℃孵育1 h，再加入PI染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析。

1.3.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PCNA、Survivin、p21、p27及p-ERK1/2蛋白的表達(dá) 將8×103個(gè)HL-60細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）的U0126處理HL-60細(xì)胞48 h，在冰浴條件下將6孔板中細(xì)胞刮下來(lái)，離心收集細(xì)胞，并加入細(xì)胞裂解液，裂解30 min，離心獲得的上清液即是總蛋白。接著利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白煮沸10 min進(jìn)行變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液（兔抗人PCNA，Survivin，p21，p27，GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1︰100；兔抗人ERK1/2，p-ERK1/2多克隆抗，稀釋度為1︰200）孵育，4 ℃過(guò)夜；二抗溶液室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件統(tǒng)計(jì)各抗體條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U0126對(duì)HL-60細(xì)胞活力的影響 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細(xì)胞24、48、72 h后，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率顯著提高（r=0.421，P<0.01），同時(shí)隨著U0126濃度升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著提高（r=0.478，P<0.01）。且在48 h細(xì)胞活力適于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，因此選擇48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。見(jiàn)表1。

2.2 U0126對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細(xì)胞48 h，經(jīng)Hoechst染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5、10、20 μmol/L的U0126能使細(xì)胞核發(fā)白，皺染，說(shuō)明細(xì)胞凋亡顯著，見(jiàn)圖1。0、5、10、20 μmol/L

的U0126作用HL-60細(xì)胞48 h，經(jīng)EdU染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能逐漸降低細(xì)胞增殖率（P<0.01），見(jiàn)圖2和表2。0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細(xì)胞48 h，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能逐漸使細(xì)胞周期阻滯在G1期（P<0.01），見(jiàn)表2。

2.3 U0126對(duì)HL-60細(xì)胞中細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 0、5，10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細(xì)胞48 h，與0 μmol/L比較，5、10、20 μmol/L的U0126能顯著下調(diào)PCNA與Survivin表達(dá)，上調(diào)p21與p27表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖3和表3。

2.4 U0126對(duì)HL-60細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平的影響 0、5、10、20 μmol/L的U0126作用HL-60細(xì)胞48 h，與0 μmol/L的（1.38±0.14）比較，5、10、20 μmol/L的U0126[（1.09±0.11），（0.72±0.70），（0.43±0.04）]均能顯著下調(diào)p-ERK1/2表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖4。

3 討論

MAPK信號(hào)通路是真核生物中一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期等多種生理病理過(guò)程。MAPK通過(guò)三級(jí)酶促反應(yīng)（MAPKKK-MAPKK-MAPK）將上游信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中使得細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答。Extracellular signal-regulated kanse（ERK）是MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵成員之一，包括兩個(gè)亞基ERK1和ERK2，外界刺激通過(guò)Ras-Raf-MEK通路將信號(hào)傳遞給ERK，ERK被磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，影響細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、增殖、凋亡、細(xì)胞周期等行為[3-4]。研究已經(jīng)表明，ERK信號(hào)通路在白血病中高度激活，并與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。U0126是MAPK信號(hào)通路特異的、高效的、可逆的抑制劑，是ATP非競(jìng)爭(zhēng)性的MEK抑制劑，不僅能夠抑制活化的MEK1/2還能抑制未活化的MEK1/2，當(dāng)U0126進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，能夠特異性地結(jié)合于MEK上，改變MEK結(jié)構(gòu)，進(jìn)而遏制MEK活性，阻斷MEK/ERK信號(hào)通路的傳遞[3-4]。研究已經(jīng)表明U0126作為MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑，能顯著地抑制黑色素瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、舌鱗癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[5-7]，但U0126在急性白血病細(xì)胞中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本課題組將對(duì)此展開(kāi)研究。本研究首先利用不同濃度（5、10、20 μmol/L）的U0126作用急性白血病HL-60細(xì)胞24、48、72 h，MTT結(jié)果表明U0216能顯著提高HL-60細(xì)胞增殖抑制率，具有時(shí)間及劑量依賴性。接著利用Hoechst染色和EdU染色進(jìn)一步檢測(cè)U0126對(duì)HL-60細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明U0126能使HL-60細(xì)胞核發(fā)白、皺染，能顯著降低細(xì)胞增殖率，進(jìn)一步說(shuō)明U0126對(duì)HL-60細(xì)胞增殖及凋亡具有顯著的抑制或誘導(dǎo)作用，與U0126在其他腫瘤細(xì)胞中的效果一致[5-7]。

細(xì)胞周期的不可控制是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖、凋亡受限制的重要原因，細(xì)胞周期主要調(diào)控點(diǎn)G1、S期，G2期也是眾多抗腫瘤藥物的主要作用靶點(diǎn)，特別是G1期，是決定著細(xì)胞是否能夠進(jìn)入S期，是否能夠正常進(jìn)行DNA復(fù)制、有絲分裂的前提[9-10]。所以本研究繼續(xù)探討U0126對(duì)HL-60細(xì)胞周期的影響，流式結(jié)果表明U0126能使細(xì)胞周期阻滯在G1期，能使細(xì)胞阻滯于DNA復(fù)制前期。細(xì)胞的增殖、凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期蛋白調(diào)控。PCNA是一種發(fā)現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡與細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白，在G1期晚期表達(dá)量大大提升，在S期達(dá)到頂峰，同時(shí)能與細(xì)胞周期蛋白（CyclinD1），細(xì)胞周期依賴性激酶（CDKs）及p21形成四聚體參與細(xì)胞周期的調(diào)控[11]。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)分子量最小的凋亡抑制因子，定位于17q25，主要表達(dá)于細(xì)胞周期的G2期。Survivin除了在胚胎組織外，在正常組織中幾乎不表達(dá)，而在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并與疾病的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是判斷腫瘤發(fā)生和預(yù)后的有效標(biāo)志物[12]。p21和p27是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑的主要成員之一，p21能抑制CyclinD1與CDK4/CDK6的結(jié)合，阻滯細(xì)胞周期于G1期。p27能抑制CyclinD1/CDK2復(fù)合物的形成，從而也使細(xì)胞周期阻滯在G1期[13]。同時(shí)有研究表明腫瘤組織中ERK信號(hào)通路的激活與PCNA、Survivin、p21及p27的高表達(dá)或低表達(dá)密切相關(guān)，提示U0126可能可以通過(guò)調(diào)控上述蛋白表達(dá)影響HL-60細(xì)胞增殖與凋亡[14-15]。所以本研究利用Western blot檢測(cè)U0126對(duì)HL-60細(xì)胞中PCNA、Survivin、p21及p27表達(dá)的影響，結(jié)果表明U0126能顯著下調(diào)PCNA與Survivin表達(dá)，上調(diào)p21與p27，此結(jié)果正好與U0126使細(xì)胞周期阻滯于G1期一致。另外本研究繼續(xù)利用Western blot檢測(cè)U0126對(duì)HL-60細(xì)胞中ERK磷酸化水平的影響，結(jié)果表明U0126能顯著的降低ERK1/2磷酸化水平。

綜上所述，5、10、20 μmol/L的U0126能顯著提高HL-60細(xì)胞增殖抑制率，具有時(shí)間及劑量依賴，同時(shí)U0126能使HL-60細(xì)胞核發(fā)白、皺染，降低細(xì)胞增殖率，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，能顯著下調(diào)PCNA與Survivin的表達(dá)，上調(diào)p21與p27，此過(guò)程與降低ERK1/2磷酸化水平有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]何海濤，李惠民.急性髓系白血病靶向治療的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2016，24（1）：245-249.

[2]Saultz J N，Garzon R.Acute Myeloid Leukemia：A Concise Review[J].J Clin Med，2016，5（3）：33.

[3]Rohrabaugh S，Kesarwani M，Kincaid Z，et al.Enhanced MAPK signaling is essential for CSF3R-induced leukemia[J].Leukemia，2017，31（8）：1770-1778.

[4]Vitagliano O，Addeo R，DAngelo V，et al.The Bcl-2/Bax and Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathways：implications in pediatric leukemia pathogenesis and new prospects for therapeutic approaches[J].Expert Rev Hematol，2013，6（5）：587-597.

[5]Stepanenko A A，Andreieva S V，Korets K V，et al.mTOR inhibitor temsirolimus and MEK1/2 inhibitor U0126 promote chromosomal instability and cell type-dependent phenotype changes of glioblastoma cells[J].Gene，2016，579（1）：58-68.

[6]夏穎，王葉，薛蓮，等.MEK特異性抑制劑U0126對(duì)A549細(xì)胞的放射增敏作用及機(jī)制研究[J].輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，2014，32（4）：12-17.

[7]劉寧，肖君剛，潘敏.MEK/ERK通路阻斷劑對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的影響[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2012，26（11）：961-965.

[8]Knight T，Irving J A.Ras/Raf/MEK/ERK Pathway Activation in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia and Its Therapeutic Targeting[J].Front Oncol，2014，4：160.

[9]Sommariva S，Tarricone R，Lazzeri M，et al.Prognostic Value of the Cell Cycle Progression Score in Patients with Prostate Cancer：A Systematic Review and Meta-analysis[J].Eur Urol，2016，69（1）：107-115.

[10]Cadoni G，Boccia S，Petrelli L，et al.A review of genetic epidemiology of head and neck cancer related to polymorphisms in metabolic genes，cell cycle control and alcohol metabolism[J].Acta Otorhinolaryngol Ital，2012，32（1）：1-11.

[11]尹俊杰，梁波，魯一，等.B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2016，24（6）：1771-1775.

[12]孫文宣，張培紅，方立環(huán)，等.Survivin在急性髓系白血病患者中的表達(dá)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21（5）：1099-1104.

[13]Wu S，Bao Y，Ma D，et al.Sodium selenite inhibits leukemia HL-60 cell proliferation and induces cell apoptosis by enhancing the phosphorylation of JNK1 and increasing the expression of p21 and p27[J].Int J Mol Med，2014，34（4）：1175-1179.

[14]Osaki L H，Gama P.MAPK signaling pathway regulates p27 phosphorylation at threonin 187 as part of the mechanism triggered by early-weaning to induce cell proliferation in rat gastric mucosa[J].PLoS One，2013，8（6）：e66651.

[15]Jiao D，Zhang X D.Myricetin suppresses p21-activated kinase 1 in human breast cancer MCF-7 cells through downstream signaling of the beta-catenin pathway[J].Oncol Rep，2016，36（1）：342-348.

（收稿日期：2018-06-25） （本文編輯：程旭然）