潘安萍 朱建偉? 楊躍

胃癌的發(fā)病率占全球惡性腫瘤的發(fā)病率的第四位，其病死率占全球癌癥相關(guān)死亡的第二位，并隨著世界人口的增多及人口老齡化的演變，胃癌的發(fā)病人數(shù)還在不斷增加［1］。β-catenin是一多功能連環(huán)蛋白質(zhì)，主要位于細(xì)胞膜，在惡性腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、藥物敏感等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)［2］。本研究擬通過沉默胃癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)，探討β-catenin蛋白表達(dá)量與胃癌細(xì)胞化療藥物敏感性之間的關(guān)系。目前5-氟尿嘧啶（5-Fu）與順鉑兩藥聯(lián)合方案是臨床胃癌化療的基礎(chǔ)治療方案［3］。5-Fu被廣泛證實(shí)在胃腸道腫瘤治療中能使患者生存獲益，含5-Fu的兩藥聯(lián)合方案是胃癌臨床研究中常見的對(duì)照方案［4］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇5-Fu藥物來探討β-catenin對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥的影響。并初步探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 胃癌細(xì)胞及主要試劑 AGS、MGC803細(xì)胞株購自上海博谷生物科技有限公司。β-catenin-RNAi慢病毒液、空載體慢病毒液購于上海吉瑪公司；RT-PCR試劑盒購于美國(guó)Sigma公司；兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國(guó)Santan Cruz公司；羊抗鼠、兔IgGHRP單克隆抗體均購于中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌AGS、MGC803用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，傳代1次/2d，按1：3比例傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 分別將慢病毒載體β-catenin-RNAi慢病毒液及空載慢病毒液分別感染AGS及MGC803細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組（感染β-catenin-RNAi慢病毒液的AGS-RNAi、MGC803-RNAi）、陰性對(duì)照組（感染空載慢病毒的AGS-Neg、MGC803-Neg）、空白對(duì)照組（未處理的AGS、MGC803）。

1.4 病毒感染 將兩株細(xì)胞稀釋成1×104/ml，種6孔板，待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組細(xì)胞每孔滴加各自慢病毒液，正常細(xì)胞組加入等體積的完全培養(yǎng)基。24h后給細(xì)胞換液，3d后熒光倒置顯微鏡下觀察熒光顯示情況。轉(zhuǎn)染效率=帶綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 Western blot分析各組細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)量 蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白分析試劑盒分析蛋白濃度。配置聚丙烯凝膠，各組蛋白均取20μl行蛋白電泳，后將目的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至NC膜，5%的脫脂奶粉封閉1h，一抗（1∶1000）4℃封閉過夜，二抗（1：2500）室溫封閉1h。暗室中滴加發(fā)光液后進(jìn)行曝光、顯影、定影，得到的膠片可行結(jié)果分析，以β-ation為內(nèi)參。

1.6 RT-PCR 分析各組細(xì)胞內(nèi)β-catenin在基因水平表達(dá)情況，用Trizol提取各組細(xì)胞內(nèi)的總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)量提取的RNA的濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，用RT-PCR試劑盒進(jìn)行RTPCR。

1.7 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞在不同濃度的5-Fu條件下的存活情況 各組細(xì)胞均稀釋至104/ml備用。5-Fu藥物共設(shè)7個(gè)藥物濃度梯度：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml。種96孔板：實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組每孔加細(xì)胞懸液100μl，調(diào)零組每孔加100μl的完全培養(yǎng)基，每組均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。每組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均種3板，分別于藥物作用24h、48h、72h后取出測(cè)量。取出的96孔板每孔加20μl MTT溶液，置培養(yǎng)箱中4h后終止，每孔加入150μl二甲基亞砜，低速振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況 轉(zhuǎn)染4d后，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的熒光顯示情況與普通光鏡下作對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組細(xì)胞顯示強(qiáng)綠色熒光，且?guī)ЬG色熒光的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例均＞80%，而空白對(duì)照組細(xì)胞無綠色熒光，兩組細(xì)胞熒光顯示情況見圖1。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)水平 RTPCR結(jié)果以2-ΔΔCt值為觀察指標(biāo)，AGS、AGS-Neg、AGS-RNAi分別為2.09±0.13、2.00±0.10、1.04±0.08；MGC803、MGC803-Neg、MGC803-RNAi分 別 為1.11±0.07、1.23±0.12、0.45±0.06。兩株胃癌細(xì)胞均顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)β-catenin在基因水平較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組降低（P＜0.05），但陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)量 Western blot得出的蛋白條帶如圖2。Image J測(cè)出各組細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋 白 相 對(duì) 表 達(dá) 量，AGS、AGS-Neg、AGS-RNAi分 別 為1.0371±0.0712、1.0667±0.0273、0.2452±0.0032；MGC803、MGC803-Neg、MGC803-RNAi分 別 為0.8725±0.0110、0.8593±0.0074、0.4220±0.0164。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)均較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組降低（P＜0.05），陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞慢病毒感染后熒光顯微鏡及普通顯微鏡對(duì)比圖（×100）

2.4 β-catenin表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞5-Fu敏感性的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：相同濃度的5-Fu作用24h后對(duì)兩株實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的抑制率明顯高于其相應(yīng)陰性對(duì)照組（P＜0.01）。而相同濃度的5-Fu作用24h后對(duì)陰性對(duì)照組細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞之間的增殖抑制率無明顯差異（P＞0.05）。相同濃度的5-Fu作用48h、72h后均得到類似的結(jié)果。

2.5 β-catenin表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞中DPD、TS及P-gp表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)條帶如圖3。TS、P-gp在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)量較陰性對(duì)照及空白對(duì)照組均低（P＜0.01），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間無明顯差異（P＞0.05）；DPD蛋白表達(dá)量在各組間均無明顯差異（P＞0.05）。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)DPD、TS、P-gp蛋白表達(dá)條帶與內(nèi)參條帶對(duì)比圖（注：1～6分別指AGS、AGS-Neg、AGS-RNAi、MGC803、MGC803-Neg、MGC803-RNAi）

3 討論

胃癌是一種常見疾病，具高發(fā)病率及病死率。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，部分腫瘤通過早發(fā)現(xiàn)、用新藥、多學(xué)科聯(lián)合等多種手段，疾病控制率已明顯改善，然而胃癌疾病控制率及病死率一直居高不下。除了近年來胃癌治療的有效新藥更新外，還與現(xiàn)有的化療藥物耐藥嚴(yán)重有關(guān)。幾乎臨床化療的胃癌患者在治療過程中應(yīng)用過5-Fu或其衍生物。但5-Fu的耐藥性問題不容忽視。β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，其被發(fā)現(xiàn)與腫瘤密切相關(guān)。β-catenin可通過影響Wnt信號(hào)通路下游的靶蛋白的表達(dá)來影響腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，其中除了細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移外，還能夠影響腫瘤細(xì)胞的化療藥物敏感性［2］。但是目前對(duì)于β-catenin與腫瘤化療藥敏之間關(guān)系的研究多數(shù)是在腸癌、乳腺、肝癌等中開展，對(duì)于胃癌細(xì)胞的研究尚少［5］。因此本研究選取β-catenin相對(duì)高表達(dá)的AGS、MGC803兩株胃癌細(xì)胞進(jìn)行研究，以探討β-catenin蛋白表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞5-Fu敏感性的影響。

本研究通過下調(diào)胃癌細(xì)胞AGS及MGC803中β-catenin蛋白表達(dá)，然后測(cè)量不同濃度的5-Fu藥物對(duì)慢性病毒感染前后細(xì)胞增殖率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)了β-catenin蛋白表達(dá)之后的兩株胃癌細(xì)胞均對(duì)多個(gè)濃度的5-Fu較正常細(xì)胞出現(xiàn)更明顯的生長(zhǎng)抑制，且AGS細(xì)胞株差異更顯著。作者猜測(cè)可能與沉默β-catenin蛋白表達(dá)效率在AGS細(xì)胞要高于MGC803細(xì)胞有關(guān)。因此，β-catenin低表達(dá)的細(xì)胞，對(duì)5-Fu藥物更敏感，而β-catenin高表達(dá)的胃癌細(xì)胞，易產(chǎn)生5-Fu耐藥。

目前國(guó)內(nèi)外研究顯示，胃癌細(xì)胞耐藥與多藥耐藥（MDR）機(jī)制有關(guān)。MDR相關(guān)基因ABCB1編碼的一種P-糖蛋白（P-gp）在細(xì)胞內(nèi)能作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)泵將多種細(xì)胞毒藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外使得胞內(nèi)藥物低水平，進(jìn)而降低藥物療效引發(fā)耐藥［6］。近年來發(fā)現(xiàn)β-catenin作為轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控P-gp表達(dá)從而參與癌癥耐藥［7］。但是5-Fu的耐藥機(jī)制除了與MDR機(jī)制有關(guān)外，還有其自身特殊的機(jī)制。研究較多的是二氫嘧啶脫氫酶（DPD）及胸苷酸合成酶（TS）。DPD是5-Fu代謝的關(guān)鍵酶，其表達(dá)上調(diào)能加速5-Fu的降解從而降低藥物療效，有研究證實(shí)DPD的表達(dá)量與腸癌、食管癌的療效密切相關(guān)［8］。TS是5-Fu作用的靶酶，5-Fu與TS結(jié)合形成復(fù)合物能干擾DNA的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究證實(shí)TS低表達(dá)的腸癌患者更易從5-Fu為基礎(chǔ)的化療中獲益且預(yù)后相對(duì)更好［9］。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于腫瘤細(xì)胞5-Fu耐藥機(jī)制的研究眾多，基本明確與TS、DPD酶的表達(dá)量密切相關(guān)，且目前這類研究主要在腸癌細(xì)胞中進(jìn)行［8］，關(guān)于胃癌細(xì)胞與5-Fu藥物敏感性之間的研究文獻(xiàn)不多，且尚無研究通過影響β-catenin蛋白表達(dá)來觀察其下游靶分子（TS、DPD、P-gp）表達(dá)異常后胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感的變化，從而探討β-catenin蛋白表達(dá)與胃癌細(xì)胞5-Fu耐藥之間的關(guān)聯(lián)性，因此，本研究通過沉默β-catenin蛋白表達(dá)，初步探索胃癌細(xì)胞5-Fu耐藥進(jìn)一步可能機(jī)制。

本研究得出β-catenin下調(diào)后的胃癌細(xì)胞內(nèi)P-gp、DPD及TS的表達(dá)量也有部分改變。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中DPD的表達(dá)量與對(duì)照組無明顯差異，但P-gp及TS的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中均出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的下調(diào)。P-gp作為Wnt信號(hào)通路的下游靶蛋白，有可能參與了β-catenin對(duì)胃癌細(xì)胞5Fu敏感性的影響。但目前少有研究證實(shí)TS為β-catenin的下游靶蛋白，但是靶向Wnt信號(hào)通路其他成分間接通過TS酶影響5-Fu敏感性的研究已在腸癌、卵巢癌及口腔癌中有證實(shí)［5，9］。就目前來說，雖然關(guān)于TS酶表達(dá)與5-Fu敏感性之間的關(guān)系尚有爭(zhēng)議，但是大部分研究認(rèn)為TS酶的表達(dá)量高的細(xì)胞更易產(chǎn)生5-Fu耐藥。且本研究同樣發(fā)現(xiàn)下調(diào)β-catenin表達(dá)后的胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性增強(qiáng)，同時(shí)TS酶的表達(dá)量下調(diào)。因此，β-catenin對(duì)胃癌細(xì)胞5-Fu敏感性的影響有可能是通過影響細(xì)胞內(nèi)P-gp及TS蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。