楊麗霞，陳勇強(qiáng)，孫 艦

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.晉中學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，山西晉中030619；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽思斯醫(yī)藥學(xué)院，廣西南寧530222）

尾葉香茶菜 （Rabdosia excisa（Maxim.）Hara）又名龜葉草，是唇形科香茶菜屬（Rabdosia）植物，在我國的東北、日本、朝鮮以及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)都有分布［1］，全草入藥，具有清熱解毒、健胃、活血的功效。用于治療胃炎、膀胱脹痛、感冒發(fā)熱、乳腺癌、關(guān)節(jié)痛、蛇蟲咬傷等［2］。藥理研究表明，尾葉香茶菜中的二萜類化合物Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C和Kamebanin對P388有明顯的抑制作用［3-4］。目前，用于尾葉香茶菜藥材質(zhì)量控制與評價(jià)的方法主要是對尾葉香茶菜活性成分含量的精確測定［5-7］，不能全面科學(xué)地控制與評價(jià)尾葉香茶菜藥材質(zhì)量；同時(shí)，多個(gè)活性成分的含量測定需要耗費(fèi)多種對照品，而一些對照品又存在難以制備、不穩(wěn)定、難以獲得或價(jià)格昂貴等問題。一測多評法的應(yīng)用可以解決對照品缺乏的難題。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測定了尾葉香茶菜中Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C和Kamebanin的含量，并利用以上4種二萜類物質(zhì)內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系，采用一測多評法［8-9］，以 Kamebakaurin 為內(nèi)參物，計(jì)算得 excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin與Kamebakaurin之間的相對校正因子（fk/s），從而得出4種二萜類物質(zhì)的含量，為更確切評價(jià)尾葉香茶菜藥材的質(zhì)量提供了新的分析模式。

1 材 料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Shim-pack VP-ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），InertSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）均為日本島津公司；DV215CD分析天平（十萬分之一，美國OHAUS公司）；DV114C分析天平（萬分之一，美國OHAUS公司）；KQ5200V超聲清洗儀（江蘇省昆山市淀山湖鎮(zhèn)）。

1.2 試 藥

8批尾葉香茶菜藥用植物采集于遼寧本溪、撫順、丹東、鞍山，并按照《中國藥典》2015版（一部）規(guī)定進(jìn)行干燥，粉碎，過40目篩等預(yù)處理［10］；對照品 Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C和Kamebanin由本實(shí)驗(yàn)室制備，純度均在98%以上。乙腈（色譜純，天津四有生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）；甲醇（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC定量方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（體積比23∶77）；流速 1.0 mL/min；運(yùn)行時(shí)間 65 min；柱溫25℃；檢測波長230 nm；進(jìn)樣量20 μL；兩次進(jìn)樣之間用流動相平衡15 min。色譜圖見圖1。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品Kamebakaurin 16.82 mg、excisaninA 5.85 mg、rabdokunmin C 4.82 mg和Kamebanin 4.38 mg分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。分別精密吸取上述溶液各1.0 mL置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻即得混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取干燥尾葉香茶菜藥材均勻粉末，精密稱取1.0 g，用甲醇提取3次（2 h、1.5 h、1 h），每次加甲醇 15 mL，水浴加熱回流溫度72℃，合并提取液，減壓過濾得浸膏，加甲醇溶解浸膏并定容至100 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取其濾液，即得。

圖1 混合對照品(A)和供試品(B)HPLC圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密稱量化合物Kamebakaurin、excisaninA、rabdokunmin C 和 Kamebanin的對照品，分別配制成濃度為0.005 mg/mL，0.015 mg/mL，0.03 mg/mL，0.06 mg/mL，0.12 mg/mL，0.24 mg/mL的單一對照品溶液，分別取上述對照品溶液20 μL 進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量（X，μg）對峰面積積分值（Y）進(jìn)行回歸，得 Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin 的回歸方程，見表 1，各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍（0.1～4.8 μg）內(nèi)線性良好。

表1 4種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰峰面積，計(jì) 算 得 Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin峰面積的 RSD（n=6）分別為 0.73%、0.52%、0.44%、0.34%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取干燥尾葉香茶菜藥材均勻粉末（新賓8月）1.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)制得供試品溶液，在0～12 h內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣1次，每次進(jìn)樣20 μL，測定峰面積。利用峰面積平均值考察樣品在甲醇溶液中的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，化合物Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin 在各時(shí)間點(diǎn)峰面積的RSD（n=6）分別為0.94%、1.12%、1.18%、1.09%，說明樣品在甲醇中12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取干燥尾葉香茶菜藥材均勻粉末（新賓8月）6份，每份 1.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)制得6份供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取其濾液20 μL進(jìn)樣分析。測定結(jié)果顯示，樣品中化合物 Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin含量的RSD（n=6）分別為0.92%、1.17%、1.25%、1.62%，說明重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取尾葉香茶菜藥材均勻粉末6份，每份1.0 g，精密稱定，分別向其中加入對照品 Kamebakaurin 5.40 mg、excisanin A 2.48 mg、rabdokunmin C 1.18 mg、Kamebanin 1.18 mg，按“2.1.3”項(xiàng)制得6份加標(biāo)提取液，各取25.0 mL稀釋至50 mL，得6份加標(biāo)溶液。另取尾葉香茶菜藥材均勻粉末6份，每份1.0 g，同“2.1.3”項(xiàng)制得6份供試品溶液。取供試品溶液和加標(biāo)溶液分別進(jìn)樣分析，測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果化合物Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin的平均回收率分別為99.66%（RSD為0.89%）、99.75%（RSD為1.97%）、99.50%（RSD 為 2.27%）、99.86%（RSD為2.01%），表明方法的準(zhǔn)確度符合要求（n=6）。

2.1.9 耐用性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［11］方法，分別考察流動相配比變化±2%、柱溫變化±2℃、檢測波長變化±2 nm、體積流量變化±10%，以及采用3根不同色譜柱（Diamonsil C18色譜柱，Shim-pack VP-ODS C18色譜柱，InertSustain C18色譜柱）進(jìn)行測定時(shí)，儀器色譜行為的變化。結(jié)果顯示，不同條件下所測得四種二萜類成分含量的RSD均在2.3%以內(nèi)，分離效果良好。因此，尾葉香茶菜中的四種二萜類成分測定條件較寬，具有較好的耐用性［12］。

2.2 相對校正因子（fk/s）的計(jì)算

2.2.1 多點(diǎn)校正法 參照文獻(xiàn)［11-13］方法，按照公式fk/s＝（Cs×Ak）/（Ck×As）計(jì)算，得到其他成分相對于Kamebakaurin的fk/s。結(jié)果見表2。同時(shí)可根據(jù)公式Ck′＝（Cs×Ak′）/（fk/s×As）計(jì)算其他三種待測成分的質(zhì)量濃度。

2.2.2 斜率校正法 參照文獻(xiàn)方法［11］，按照斜率校正法公式fk/s＝ak/as計(jì)算（其中as為“2.1.4”項(xiàng)下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)參物斜率，ak為“2.1.4”項(xiàng)下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線其他對照組分斜率），得出excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin相對于Kamebakaurin的 fk/s分別為0.952、0.933、1.042。同時(shí)可根據(jù)公式Ck′＝Ak′/（as×fk/s）計(jì)算其他三種待測成分的質(zhì)量濃度。

2.3 fk/s重現(xiàn)性考察

實(shí)驗(yàn)考察了兩種儀器下3根色譜柱（Diamonsil C18色譜柱，Shim-pack VP-ODS C18色譜柱，InertSustain C18色譜柱）對fk/s的影響。結(jié)果見表3。

表2 以Kamebakaurin為參照的fk/s（多點(diǎn)校正法）

表3 不同儀器和色譜柱下的fk/s

2.4 待測組分的色譜峰定位

利用相對保留時(shí)間進(jìn)行定位，即以Kamebakaurin為基準(zhǔn)峰，計(jì)算不同儀器和色譜柱下excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin峰相對保留時(shí)間。結(jié)果見表4。

2.5 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

分別精密吸取8批尾葉香茶菜供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣分析，記錄 Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C及Kamebanin的峰面積，用外標(biāo)法和兩種一測多評法分別計(jì)算四種組分的含量，結(jié)果見表5?？傻?，尾葉香茶菜中的4種二萜類成分在不同采收期、不同采收地含量差異較大。采用t檢驗(yàn)法，對多點(diǎn)校正法與外標(biāo)法得到的尾葉香茶菜藥材中 excisanin A、rabdokunmin C、Kamebanin的含量進(jìn)行比較，P＞0.05，表明兩種方法測得的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多點(diǎn)校正法與外標(biāo)法所得含量間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，說明多點(diǎn)校正法應(yīng)用于尾葉香茶菜藥材的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價(jià)中是可行的。采用t檢驗(yàn)法，對斜率校正法與外標(biāo)法得到的尾葉香茶菜藥材中以上3種二萜類成分的含量進(jìn)行比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明兩種方法測得的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多點(diǎn)校正法與外標(biāo)法所得含量間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差部分大于5%，說明斜率校正法應(yīng)用于尾葉香茶菜藥材的質(zhì)量評價(jià)有欠妥當(dāng)。

表4 不同儀器和色譜柱下各色譜峰相對保留時(shí)間

3 討 論

考察了水、乙醇、甲醇3種提取溶劑，室溫冷浸、超聲提取、回流提取、索氏提取、微波提取5種提取方法，結(jié)果以甲醇加熱回流提取的效率最佳，樣品色譜圖譜特征峰最為明顯，因此本實(shí)驗(yàn)選用甲醇加熱回流提取。

Kamebakaurin、excisanin A、rabdokunmin C 及Kamebanin是尾葉香茶菜的主要特征性成分，在藥材中含量較高，藥理活性顯著，是評價(jià)尾葉香茶菜藥材質(zhì)量的適宜指標(biāo)。因此實(shí)驗(yàn)中選取這4種化合物作為質(zhì)控指標(biāo)，并建立它們之間的相對校正因子fk/s。鑒于化合物Kamebakaurin在尾葉香茶菜中含量最高、易于制取、藥效顯著，實(shí)驗(yàn)中選用Kamebakaurin為內(nèi)參物，建立該成分與其他3種活性成分間的相對校正因子fk/s。

表5 尾葉香茶菜中四種成分不同方法定量測定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)首次采用兩種一測多評法多點(diǎn)校正法和斜率校正法對尾葉香茶菜藥材的4種二萜類成分同時(shí)進(jìn)行含量測定。斜率校正法作為其中一種一測多評法進(jìn)行待測組分含量計(jì)算時(shí)，由于不同儀器峰面積計(jì)算方式不一，使得定量因子fk/s出現(xiàn)一定差異，所以每臺儀器的fk/s需單獨(dú)建立，在評價(jià)中存在一定的局限性。從表5可得，用斜率校正法所計(jì)算的結(jié)果與外標(biāo)法所得結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而多點(diǎn)校正法所計(jì)算的結(jié)果與外標(biāo)法所得結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且不同實(shí)驗(yàn)條件下各成分間的fk/s重現(xiàn)性良好（RSD＜5%），說明多點(diǎn)校正法在對照品缺乏的前提下，可以作為一種方便、快捷、準(zhǔn)確的方法應(yīng)用于尾葉香茶菜藥材多成分的含量測定和藥材質(zhì)量的初步評價(jià)。

實(shí)驗(yàn)中利用相對保留時(shí)間進(jìn)行待測組分色譜峰定位（RSD＜5%），但鑒于尾葉香茶菜藥材色譜峰較復(fù)雜，為了保證QAMS色譜峰定位的準(zhǔn)確性，應(yīng)當(dāng)結(jié)合光譜法或質(zhì)譜法進(jìn)行定位。