鄭春娟， 鄧婷婷， 來亞鵬,2， 劉 剛， 王 娟*

（1. 深圳大學(xué) 生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東 深圳 518060；2. 深圳大學(xué) 生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 深圳 518060）

纖維素酶是一個具復(fù)雜水解功能的酶系，能將纖維素水解最終生成葡萄糖。許多絲狀真菌都能夠產(chǎn)生豐富的纖維素酶系。在自然界中，真菌產(chǎn)生的纖維素酶分布最廣，是降解木質(zhì)纖維素的重要來源。此外，纖維素酶廣泛應(yīng)用于飼料釀造、食品加工、中草藥有效成份提取、果蔬加工和石油開采等行業(yè)，有效提高了產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，從而獲得顯著的經(jīng)濟效益。

纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)中，獲得更高生產(chǎn)性能的菌株對于提高經(jīng)濟效益具有關(guān)鍵作用。研究表觀遺傳修飾對木質(zhì)纖維素酶基因表達的調(diào)控，對提高生產(chǎn)中的酶活性具有重要理論意義和應(yīng)用價值。本文綜述近幾年DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA的調(diào)控等表觀遺傳修飾方式在真菌纖維素酶的表達調(diào)控中的重要作用。

1 真菌纖維素酶的種類與結(jié)構(gòu)

真菌產(chǎn)的纖維素酶可分為三大類：外切葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶。1）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase），作用于β-1,4-糖苷鍵，每次切下纖維素線性分子末端一個纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶（β-1,4-D-glucan cellobiohydrolase或cellobiohydrolase，簡稱CBH）；2）內(nèi)切葡萄糖苷酶（β-1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases或 endo-1,4-β-D-glucannase，簡稱 EG），隨機作用于不溶性纖維素表面 β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生大量具非還原性末端的小分子纖維素；3）β-葡萄糖苷酶（β-D-glucoside glucohydrolases或β-glucosidase，簡稱 BG），可將纖維二糖甚至纖維三糖水解成葡萄糖分子。真菌中產(chǎn)生的三類酶的共同作用，可將纖維素水解為葡萄糖[1]。

幾乎所有纖維素酶都是由一個是具有催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain，CD）、結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cellulose binding domain，CBD）以及一個高度糖基化的連接肽（1inker）這三部分組成的[2]。CBH的CD可沿纖維素鏈向結(jié)晶區(qū)單方向持續(xù)催化產(chǎn)生纖維二糖[3]。研究表明CBH的CBD具有吸附纖維素，使纖維素聚合物氫鍵斷裂形成短纖維的作用，有的纖維素酶沒有CBD結(jié)構(gòu)，但并不影響其水解功能[4]。Linker負責(zé)將纖維素酶的催化區(qū)連接到CBD上并把CD與CBD適當(dāng)隔開以維持兩邊的相對活性。

2 真菌纖維素酶基因的表達調(diào)控機制

纖維素酶基因是一個多基因家族，每個基因都有其自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，也有一些基因共享同一個轉(zhuǎn)錄因子。目前從里氏木霉（Trichoderma reesei，T·reesei）中鑒定出的纖維素酶基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子有 ACE1、ACE2、CRE1和XYR1等[5-7]。ACE1與ACE2是纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，ACE1是三個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的纖維素酶基因正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，ACE2起負調(diào)控作用。CRE1是典型的碳源代謝阻遏抑制因子，如葡萄糖等簡單單糖存在時，CRE1發(fā)揮阻遏作用。XYR1是cbh1、cbh2、egl1、bgl1、xyn1和xyn2等主要纖維素酶和半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄所必須的激活因子[8]。研究表明，在里氏木霉中，cbh1編碼纖維二糖水解酶CBH1，egl1編碼內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶EGL1[6]。在里氏木霉中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有上面4個轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)cbh1啟動子。有研究發(fā)現(xiàn)，在紅褐肉座菌（H. jecorina）中蛋白復(fù)合物Hap2 /3 /5也參與cbh2基因的表達，但具體作用未見詳述[9]。

纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄是主要由纖維素及其衍生物（纖維二糖和槐糖）、乳糖和單糖山梨糖誘導(dǎo)的，并受制于碳源代謝阻遏。已有研究表明，XYR1、ACE2和ACE1基因的表達都是由乳糖誘導(dǎo)的。XYR1也由D-半乳糖誘導(dǎo)，但這種誘導(dǎo)與D-半乳糖代謝無關(guān)[7]。

3 表觀遺傳修飾在真菌纖維素酶基因調(diào)控中的作用

表觀遺傳機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、非編碼RNA的調(diào)控等，這些機制相互作用形成特定功能所需的特異染色質(zhì)，以調(diào)節(jié)基因表達[10]。DNA甲基化是研究最多的表觀遺傳修飾之一，它通常使基因表達受到抑制[11]。組蛋白修飾包括組蛋白的甲基化與去甲基化、乙酰化與去乙?；?。乙?；悄壳把芯康淖钌钊氲呐c轉(zhuǎn)錄有關(guān)的組蛋白修飾方式。參與維持組蛋白乙?；胶獾闹饕甘墙M蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HATs）。而非編碼RNA的調(diào)控包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（micro RNA）以及長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）的調(diào)控作用。

一般認為，在真核生物主動轉(zhuǎn)錄的基因與組蛋白H3和H4的不同賴氨酸殘基上的乙?；约稗D(zhuǎn)錄活躍指示區(qū)H3K4的甲基化有關(guān)。近年來，有關(guān)表觀遺傳修飾在真菌纖維素酶基因表達調(diào)控中作用的研究不斷深入。

3.1 DNA 甲基化對纖維素酶表達的影響

DNA甲基化在哺乳動物、植物和真菌中都是重要的表觀遺傳標記。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，僅粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、多頭絨泡菌（Physarum polycephalum）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、布拉克須霉（Phycomyces blakesleeanus）等少數(shù)真菌胞嘧啶甲基化程度較高[12]。真菌DNA甲基化位點與植物相同，主要位于轉(zhuǎn)座子和其他重復(fù)序列，進而控制基因的表達與沉默。

在粗糙脈孢菌中首次發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列誘導(dǎo)的點突變（repeat induced point mutation，RIP）以及在糞盤菌（Ascobolus immersus）中發(fā)現(xiàn)的減數(shù)分裂前誘導(dǎo)的甲基化（methylation induced premeiotically，MIP）均是通過與轉(zhuǎn)座子或其他重復(fù)序列結(jié)合，發(fā)送甲基化信號[13-14]。在粗糙脈孢菌和糞盤菌中，組蛋白H3的胞嘧啶甲基化和典型異染色質(zhì)區(qū)域H3K9的三甲基化參與異染色質(zhì)形成[15-16]。在真菌中，轉(zhuǎn)座子只要長度足夠被RIP或者MIP結(jié)合，均被高度甲基化。已有研究證明，甲基化相關(guān)的沉默是通過阻止這些真菌中的轉(zhuǎn)錄延伸發(fā)揮作用的[17]。目前為止，真菌中已發(fā)現(xiàn)的5種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DMT）。在粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)的DIM-2可持續(xù)或從頭甲基化轉(zhuǎn)座子，這些DNMTs中的任何一種的突變在表型中都沒有表現(xiàn)出明顯的缺陷[14,18-19]。

近年來，化學(xué)修飾試劑成為研究真菌甲基化機制的重要手段。周嬌嬌等在含0.1 mmol/L 5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-2?-deoxycytidine , 5?-Aza）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)里氏木霉T.reesei QM9414，發(fā)現(xiàn)該菌株DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達比出發(fā)菌株明顯降低，全基因組DNA甲基化程度也有下降，cbh1、egl1和xyr1 基因表達水平增加。經(jīng)酶活測定發(fā)現(xiàn)羧甲基纖維素鈉酶活性（carboxymethyl cellulose-Na enzymatic activities，CMCA）以及濾紙酶活性（filter paper enzymatic activities，F(xiàn)PA）明顯增加[20]。同樣，5?-Aza刺激灰霉病酶（Humicola grisea var. thermoidea，Hgvt）96小時后木聚糖酶活性增加。在含葡萄糖（Glu）培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)5?-Aza使Hgvt細胞生物水解酶和XYN-2木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄積累增加，而在小麥麩皮（WB）上培養(yǎng)時，檢測到5’-Aza增強了轉(zhuǎn)錄因子CreA基因的表達[21]。

上述研究表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 5?-Aza可能是通過作用于調(diào)節(jié)纖維素酶基因表達調(diào)控因子ACE1、ACE2、CRE1和XYR1等的表達，進而在轉(zhuǎn)錄水平上影響纖維素酶以及木聚糖酶基因的表達。

3.2 蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶對纖維素酶表達的影響

蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶LaeA是一種廣泛的調(diào)節(jié)因子，對幾種真菌多種次生代謝物基因簇的表達產(chǎn)生影響。在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，LaeA、VeA 以及VelB共同構(gòu)成VELVET蛋白復(fù)合物，LaeA有修飾異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用[22]。在草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）中，LaeA不僅調(diào)節(jié)糖苷水解酶基因的表達，而且調(diào)節(jié)糖苷水解酶相關(guān)重要轉(zhuǎn)錄因子基因clrB、xlnR和creA的表達。在laeA基因座上引入野生型laeA拷貝后，laeA突變株的生長缺陷和纖維素酶合成缺陷得到了恢復(fù)。但laeA基因突變激活了β-木糖苷酶基因 xyl3A的表達，胞外木糖苷酶活性提高了 5倍以上，表明 LaeA對胞外木糖苷酶的形成有負調(diào)控作用[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，里氏木霉中LaeA直系同源物蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶LAE1是性發(fā)育的調(diào)節(jié)器，同時又調(diào)節(jié)纖維素酶和多糖水解酶的表達[24]。Seiboth B等在乳糖誘導(dǎo)的條件下，敲除lae1基因的里氏木霉菌株纖維素酶活性比親本菌株顯著降低。以木聚糖為碳源時，lae1基因突變體中木聚糖酶活性亦顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，LAE1可控制糖苷水解酶基因和轉(zhuǎn)錄激活因子 XYR1基因的表達，同時調(diào)控碳水化合物酶類（CAZymes）基因家族的表達，但并不直接甲基化CAZymes編碼區(qū)的H3K4或H3K9。纖維素酶基因表達的LAE1依賴性與誘導(dǎo)無關(guān)[25]。表明在里氏木霉中，幾乎所有纖維素酶的表達都依賴于LAE1。目前，蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶LAE1甲基化的靶蛋白在任何生物體中均未被鑒定[26]。

VeA是調(diào)節(jié)多種真菌的形態(tài)發(fā)生和次生代謝的基因，在黃曲霉（Aspergillus flavus）中，VeA是淀粉酶和蛋白酶活性依賴性調(diào)節(jié)因子[27]。在里氏木霉中，VeA的直系同源物是 VEL1。VEL1突變體在乳糖作為纖維素酶誘導(dǎo)碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，纖維素酶、木聚糖酶和纖維素酶正調(diào)控因子XYR1被完全破壞，這表明VEL1對于纖維素酶等多種酶的形成是必需的[28]。

LaeA以及VeA在纖維素酶表達調(diào)控中具有重要影響，由于LaeA及其同源物在次生代謝和其他生物技術(shù)中的重要性，LaeA成為生物技術(shù)重要真菌菌株改良的主要焦點。

3.3 組蛋白乙?；?、甲基化對纖維素酶表達的影響

HAT家族成員組蛋白乙?；妇幋a基因gcn5最初在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被鑒定出來。Xin等對gcn5在里氏木霉中的同源基因TrGcn5進行突變，羧甲基纖維素（CMC）或結(jié)晶纖維素誘導(dǎo)下重組菌株中無明顯的纖維素酶表達異常，但在乳糖誘導(dǎo)條件下，表現(xiàn)出極低的 CBH酶活，通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）結(jié)果證明 cbh1基因的轉(zhuǎn)錄激活幾乎被消除，而另外兩個糖苷酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄不產(chǎn)生影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TrGcn5可能通過乙?；w維素酶基因啟動子中特定的組蛋白尾部使染色質(zhì)重塑，進而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄激活[29]。

在水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）中，蛋白復(fù)合物VELVET由Vel1、Vel2以及Lae1構(gòu)成。Lae1是LaeA的直系同源物，主要參與次級代謝基因簇的調(diào)控，但也影響基因的表達編碼轉(zhuǎn)綠因子、組蛋白修飾物、轉(zhuǎn)運蛋白和幾種其他功能型蛋白質(zhì)。Lae1突變體中過表達組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HAT1導(dǎo)致某些生物合成的部分恢復(fù)，表明HAT1在水稻惡苗病菌中可能與Lae1參與相同的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[30]。周嬌嬌等在里氏木霉中敲除編碼組蛋白H3賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histone H3 lysine methyltransferase，HKMT）以及組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）的基因后，組蛋白的甲基化修飾與去乙?；揎棻灰种?，同時熒光定量 PCR檢測到 cbh1、egl1與 xyr1基因的表達水平顯著增加，明顯纖維素酶的表達被激活[31]。結(jié)果表明HKMT和HDAC均參與調(diào)控里氏木霉纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達。

Ba Van Vu等發(fā)現(xiàn)纖維素酶基因表達存在雙向調(diào)控機制。在 2%CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)下，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中編碼纖維素酶的基因MoCel7C（MGG_14954）轉(zhuǎn)錄物的水平相比出發(fā)菌株增加超過1 000倍，而在MoSET1基因突變體在非誘導(dǎo)條件下的MoCel7C表達水平也增加。葡萄糖和纖維二糖抑制了CMC誘導(dǎo)的MoCel7C啟動子的活化，而MoCel7C基因座的H3K4甲基化也與CMC對該基因的激活有關(guān)。此外，在米曲霉（M.oryzae）中，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶MoSET1基因直接或間接地在MoCel7C基因的激活和抑制中起作用。不溶性結(jié)晶纖維素在瓊脂培養(yǎng)基上活化了MeCel7C啟動子，但不在液體培養(yǎng)基中活化，表明需要通過誘發(fā)真菌菌絲體來激活MeCel7C啟動子[32]。

3.4 非編碼RNA研究

3.4.1 siRNA

RNA干擾（RNAi）是一種自然發(fā)生的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，在基因組中，重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈異常RNA（aberrant RNA，aRNA），被復(fù)制后生成雙鏈RNA（dsRNA），并在核糖核酸內(nèi)切酶Dicer的作用下被剪切形成siRNA，siRNA隨之引發(fā)RNA干擾基因的正常表達。RNAi技術(shù)可以在降低基因表達量的同時，幾乎不會對真菌生長產(chǎn)生系列嚴重反應(yīng)或致死，因而RNAi可用于對轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的研究[33]。

目前，RNAi在真菌纖維素酶基因表達調(diào)控研究中應(yīng)用逐漸增加。但大部分使用的是長鏈RNAi技術(shù)以及誘導(dǎo)型干擾載體。利用 RNAi技術(shù)干擾纖維素酶高產(chǎn)突變體康寧木霉（T. koningii YC01，GenBank:JQ291608）的 cre1基因的表達，發(fā)現(xiàn) cre1的部分沉默導(dǎo)致木聚糖酶和纖維素酶調(diào)節(jié)因子 XYR1的表達升高[34]。

在對其他阻遏因子ACE1的基因不產(chǎn)生影響的條件下，表達組成型siRNA載體干擾里氏木霉碳阻遏抑制因子cre1后，cre1基因的表達下降50%，在第6天時，cre1干擾重組菌中的cbh1、egl1和xyr1的表達量相比親本菌株提高2倍左右，纖維素酶活力也高于出發(fā)菌株，說明干擾cre1可以解除阻遏物對部分纖維素酶基因表達的抑制[35]。王榕等將里氏木霉利用RNAi技術(shù)下調(diào)cre1基因的表達后，在轉(zhuǎn)化子中發(fā)現(xiàn)內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶的酶活均有顯著提高，但β-葡萄糖苷酶的活性有所下降。在里氏木霉中，β-葡萄糖苷酶活性主要取決于于bgl1基因，表明cre1基因可能直接或間接影響bgl1的表達[36]。本實驗室的Yang等人利用RNAi技術(shù)分別干擾嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila）中的ace1基因和轉(zhuǎn)錄因子cre1基因，證明了ace1在嗜熱毀絲霉纖維素和半纖維素酶表達中的負調(diào)控作用，對cre1干擾轉(zhuǎn)化子的研究發(fā)現(xiàn)，CRE1在嗜熱毀絲霉中對正調(diào)控因子XYR1的表達無影響[37-38]。

RNA干擾技術(shù)不僅可以干擾轉(zhuǎn)錄因子，也可以作用于轉(zhuǎn)錄相關(guān)的重要酶基因表達。周嬌嬌等對里氏木霉 gcn5進行干擾后，發(fā)現(xiàn)干擾轉(zhuǎn)化菌株中組蛋白乙?；揎棻幻黠@抑制，使得纖維素酶表達調(diào)控相關(guān)基因表達量顯著下降，從而導(dǎo)致纖維素酶活的下降[30]。進一步證明組蛋白乙酰化酶在調(diào)控里氏木霉纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達中發(fā)揮了重要作用。值得肯定的是，針對纖維素酶負調(diào)控因子設(shè)計的siRNA干擾載體，能在對菌株生長發(fā)育產(chǎn)生最低影響的條件下，進一步提高真菌中相關(guān)纖維素酶的產(chǎn)量。

3.4.2 長鏈非編碼RNA研究

長鏈的非編碼RNA（LncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本超過200 nt的RNA分子，可通過與特異mRNA結(jié)合形成雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生siRNA。在表觀遺傳機制中，LncRNA能招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物到特定位點從而導(dǎo)致相關(guān)基因的沉默。之前，在真菌中，僅在酵母中發(fā)現(xiàn)LncRNA的存在[39]。

2018年，Petra等在絲狀真菌里氏木霉QM9414中首次發(fā)現(xiàn)了一個被3’聚腺苷化的LncRNA，被稱為HAX1。HAX1僅存在于里氏木霉，并且在不同菌株QM6a、QM9414和Rut-C30中具有不同的長度，可能與其進化程度有關(guān)。在QM9414中，hax1突變體中纖維素酶表達降低，過表達hax1后得到恢復(fù)，表明HAX1參與調(diào)節(jié)纖維素酶表達。在QM6a中，發(fā)現(xiàn)HAX1的缺失并不影響表型，表達hax1后纖維素酶活性顯著提高[40]。

4 展望

在真菌中，纖維素酶的表達受到誘導(dǎo)物、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、碳源代謝阻遏作用等多重因素的影響。全面了解纖維素酶基因表達調(diào)控的各種因素及其相互作用，可提高纖維素酶產(chǎn)量、構(gòu)建出具有更高酶活的纖維素酶基因工程菌。表觀遺傳修飾作為基因表達調(diào)控的重要方式，在纖維素酶表達過程中發(fā)揮著重要作用。

目前，關(guān)于表觀遺傳修飾在真菌纖維素酶表達調(diào)控方面的研究仍相對較少，尚有許多不足。例如，雖然越來越多的研究結(jié)果表明，蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 LAE1或其同源物在多種真菌中其參與纖維素酶表達調(diào)控，但其甲基化的靶蛋白有待研究；蛋白復(fù)合物VELVET的功能值得深入挖掘；在纖維素酶基因調(diào)控中DNA甲基化以及組蛋白修飾的具體作用機制仍不明確；許多調(diào)控基因的甲基化狀態(tài)以及組蛋白修飾位點未知。對于上述問題的深入研究，將有利于人們深入理解表觀遺傳修飾對纖維素酶表達的作用機制，進一步揭示纖維素酶表達調(diào)控的機理。