張 悅 ， 季 靜 *， 關春峰 ， 金 超 ，李 倩 ， 閆 豹 ， 王 罡*， 王昱蓉

（1. 天津大學 環(huán)境科學與工程學院，天津 300072；2. 天津市天大天福生物技術有限公司，天津 300384）

我國是以農業(yè)為第一產業(yè)的大國，生物質能源每年有一半為秸稈資源，可見我國擁有相當龐大的秸稈資源保有量，但因為降解技術不發(fā)達、工業(yè)化難度較大、資源利用成本高，使秸稈綜合利用率呈現下降趨勢[1]。在秸稈的構成中，纖維素、半纖維素和木質素互相聯結呈現出復雜且不連續(xù)的層狀結構，這種結構使得秸稈降解的難度加大，進而降低了秸稈的開發(fā)與利用率[2]。目前研究與利用木質纖維素發(fā)酵的科研機構都圍繞著以下關鍵工藝進行：一是預處理工藝，即通過不同物理、化學或生物等方法，使纖維素、半纖維素和木質素的結構被破壞，從而易于被降解；二是水解工藝，即通過酸法或酶法把纖維素和半纖維素水解成五碳糖和六碳糖；三是發(fā)酵工藝，選用特殊的菌種共同培養(yǎng)，對上述的五碳糖和六碳糖進行發(fā)酵[3]。但單一的處理方法存在著成本高、耗時長或降解效率低等問題。結合秸稈資源開發(fā)優(yōu)勢大及降解難的現狀，可見秸稈資源的高效利用需進行多種工藝結合研究。

利用某些微生物可以高效降解秸稈纖維素類和木質素類物質的功能，大大提高秸稈的降解率。真菌是目前研究深入、應用廣泛的降解菌種之一。其不僅能夠分泌胞外酶，而菌絲對木質素的醋質層也有較強的機械穿透作用，大量研究表明，白腐菌對木質素的降解最為徹底，但是由于白腐菌產酶存在培養(yǎng)條件控制困難、酶活力較低、發(fā)酵周期長、生產成本高等問題，很難在短時間內培養(yǎng)出大量且均一的培養(yǎng)液。而木霉、青霉、曲霉等的菌種對胞外纖維素酶的分泌能力較強且適合大規(guī)模的固體或液體培養(yǎng)，所以在生產中得到了廣泛的應用，目前已成為市場內應用前景最佳的纖維素酶工業(yè)[4]。且研究表明復合霉菌降解秸稈與單一菌株相比失重率提高了 21.3%～59.6%[5]。而在化學方法降解秸稈的研究中，李軼[6]、杭志喜等[7]則分別研究了稀酸和堿對秸稈的降解并得到了明顯效果，降解率最高可達39.28%。

綜上所述，對秸稈進行降解的方法與工藝有很多，但單一的降解方法問題多、困難大，利用生物與化學途徑結合則可有效縮短降解時間、提高降解速率。而另一方面，因為微生物菌肥可顯著改善農田土壤生態(tài)微環(huán)境、土壤理化性質及植物營養(yǎng)狀況，可有效提高植物抗逆性，增加作物產量，目前已在農作物市場中得到廣泛應用[8]。故本實驗從菌肥中篩選出兩株纖維素酶高產霉菌，欲利用此霉菌對化學法預處理工藝進行優(yōu)化，通過秸稈干粉失重率探究不同預處理對兩株木霉降解玉米秸稈效果的影響，為農作物秸稈的高效利用提供一些理論依據。

1 實驗

1.1 材料

實驗所用預處理原材料為秸稈粉末，來自田間玉米秸稈研磨制成，約存放半年，秸稈中約含15%～17%水分，其余成分主要為纖維素、半纖維素、木質素等有機物及少量灰分；預處理試劑為冰乙酸、氫氧化鈉溶液；微生物菌肥為黑曲霉菌肥、哈茨木霉菌肥和綠色木霉菌肥。1.1.1培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g；NH4NO31 g；KH2PO41 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；蛋白胨1 g；瓊脂 20 g；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）液體培養(yǎng)基：CMC-Na 15 g；NH4NO31 g；KH2PO41 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；蛋白胨1 g；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.2 主要試驗試劑

1）0.05mol/L pH 5.0檸檬酸緩沖液

A液（濃度為0.1 mol/L 的檸檬酸溶液）：準確的稱量檸檬酸樣品21 g，溶解于蒸餾水后，移入 1 000 mL容量瓶準確定容并搖勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B液（濃度為0.1 mol/L 的檸檬酸鈉溶液）：準確的稱量檸檬酸鈉樣品29 g，溶解于蒸餾水后，搖勻并定容于1 000 mL容量瓶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別量取A液205 mL以及B液295 mL，混勻后定容于1 000 mL容量瓶中，即為配制好的0.05 mol/L，pH 5.0的檸檬酸緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）濃度為0.51%的CMC-Na標準溶液

稱量CMC-Na樣品0.51 g溶于少量檸檬酸緩沖液中，水浴鍋50℃～70℃加熱至完全溶解，再用檸檬酸緩沖液準準確容至100 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）DNS試劑

準確的稱量0.5 g 3,5-二硝基水楊酸，再加入20 mL 濃度為2 mol/L的NaOH溶液和50 mL蒸餾水充分攪拌至完全溶解后加入30 g酒石酸鈉，待其冷卻后定容于100 mL容量瓶中，最終移入棕色試劑瓶中室溫放置7 d，待其穩(wěn)定后備用。

4）濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準溶液

于105 ℃干燥葡萄糖至衡重，準確稱取0.1 g，用少量蒸餾水溶解后，移入100 mL容量瓶中準確定容并充分搖勻，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

本研究采用微生物菌種的復合體系構建與化學預處理結合的方法，通過測定降解前后玉米秸稈的失重率，探討不同預處理對兩株木霉降解玉米秸稈效果的影響。

1.2.1 秸稈粉碎

研磨玉米秸稈將其粉碎為粉末，后121℃高壓滅菌30 min，取出后60℃烘箱烘干，完成第一步玉米秸稈粉末的制備。

1.2.2 秸稈化學試劑預處理

每錐形瓶分別加入1 g粉碎秸稈，每錐形瓶分別加入不同比例化學試劑，加入量如表1所示，充分搖勻室溫培養(yǎng)7 d。

表1 化學試劑比例

1.2.3 纖維素降解菌的初篩

將不同組合培養(yǎng)獲得的單菌落培養(yǎng)皿用剛果紅進行染色，此步驟用于對不同菌種對纖維素降解的能力進行初步篩選。首先利用1 mg/mL的剛果紅染色液對待測培養(yǎng)基進行30 min染色，染色結束后棄去染液，再利用1 mol/L的NaCl溶液對培養(yǎng)基進行30 min脫色，脫色結束后棄去廢液，觀察培養(yǎng)基內是否有以菌落為中心的透明圈產生，并根據每個培養(yǎng)皿透明圈的清晰程度以及透明圈直徑和菌落直徑比值的大小可以初步判斷不同菌系對纖維素的降解能力。

1.2.4 降解纖維素復合菌系的構建

將初篩獲得的菌種接種于CMC-Na液體培養(yǎng)基中，120 r/min條件下30℃振蕩培養(yǎng)，后取培養(yǎng)液進行CMC及FPA酶活力的測定，所測酶活力大小可作為復篩的判斷依據。

粗酶液的制備方法：將待測培養(yǎng)液6 000 r/min離心10 min，取離心后上清液即為備用粗酶液。

酶活力的定義：取1 mL得酶液在1 min規(guī)定時間內水解底物所生成的1 μmol的還原糖量即為1個酶活力單位（U/mL）。

酶活力大小的計算方式：測定的酶活力大小根據公式（1）進行計算。

式中，X為待測定的酶活力大?。║/mL），S為還原糖的含量（mg），V1為稀釋后粗酶液的定容體積（mL），V2為反應加入待測酶液的體積（mL），V為待測粗酶液的體積（mL）。

1.2.4.1 酶活力的測定方法（本實驗采用還原糖法）

1）CMC酶活力的測定方法

準備4支干燥清潔的25 mL試管，1支為空白對照管，剩余3支為待測管，首先于各試管中分別加入1.5 mL CMC-Na標準溶液，再放置50℃水浴鍋中進行5 min預熱，同時將適當稀釋后的粗酶液進行預熱，并向各待測管中加入0.5 mL粗酶液，充分混勻后將其與空白管同時進行30 min的50℃水浴反應，反應結束后取0.5 mL適當稀釋的粗酶液于空白管中，并向空白管和待測管內同時加入3 mL DNS試劑，沸水浴中反應5 min，反應結束后迅速冷卻，并用蒸餾水準確定容至25 mL。在540 nm波長下，以空白對照管調零，測定待測管溶液在該波長下的吸光度大小，后根據所繪葡萄糖標準曲線確定待測液中還原糖的含量，并準確計算出CMC酶活力的大小。

2）FPA酶活力的測定

取4支干燥清潔的25 mL試管，1支為空白對照管，其余3支為待測管，首先分別稱取0.5 g濾紙條加入所有試管中，后于 50℃水浴鍋預熱 5 min，于此同時適當預熱稀釋后的粗酶液，并向各待測管中加入0.5 mL粗酶液，充分混勻后將其與空白管同時進行30 min的50℃水浴反應，反應結束后取0.5 mL適當稀釋的粗酶液于空白管中，并向空白管和待測管內同時加入3 mL DNS試劑，沸水浴中反應5 min，反應結束后迅速冷卻，并用蒸餾水準確定容于25 mL試管中。將波長調至540 nm，通過空白對照管進行調零，測定待測管溶液在該波長下的吸光度，后根據所繪葡萄糖標準曲線確定待測液中還原糖的含量，并準確計算出FPA酶活力的大小。

1.2.4.2 葡萄糖標準曲線的繪制

準備6支干燥清潔的25 mL試管，分別將不同含量的葡萄糖標準溶液和不同含量的蒸餾水加入試管中，充分的振蕩混勻后再加入3 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴反應5 min，沸水浴反應結束后將其迅速冷卻，并利用蒸餾水定容至25 mL試管中，后測定每管在540 nm波長下的吸光度大小。以葡萄糖的含量作為橫坐標，溶液的吸光度大小作為縱坐標，準確的繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.5 復合菌系與化學試劑組合

調節(jié)各組合預處理液pH值于4.5～5.5之間，按5%接種比例向各錐形瓶中接入經過篩選后纖維素酶產能力最強的復合菌系，28℃震蕩培養(yǎng)7天。

1.3 測定項目及方法

實驗結束后將各實驗組高溫滅菌，將剩余物質用無菌水進行充分洗滌后烘干至恒重，將剩余干物質質量記為M1（g），試驗前秸稈質量記為M0（g），秸稈的失重率（D）利用下述公式（2）進行計算。

式中，D為待測定的失重率，M0為發(fā)酵前的秸稈質量，M1為發(fā)酵后剩余干物質的質量。

2 結果與討論

2.1 纖維素降解菌的初篩

經剛果紅染色后所有的CMC-Na培養(yǎng)基均獲得了不同大小的透明圈，各組透明圈對比如圖1所示，透明圈直徑與菌落直徑比值的結果比較如圖2所示。

圖1 透明圈對比圖

表2 透明圈直徑與菌落直徑比值大小

圖2 不同菌系透明圈直徑與菌落直徑對比圖

圖3 葡萄糖標準曲線

由于剛果紅染液可以與纖維素類物質相互結合，所以經剛果紅染色后的復合物會呈現出紅色。但如果培養(yǎng)基中纖維素類物質已經被分解，剛果紅則因無可結合受體而在脫色中被洗滌掉，導致培養(yǎng)基中呈現出以菌落為中心的透明圈，葉姜瑜等人認為能夠利用透明圈的是否產生作為微生物菌落是否具有產生纖維素酶能力的判斷依據[9]。高榕等人又進一步的提出，可以利用透明圈直徑和菌落直徑的比值大小來判斷菌種降解纖維素能力的大小，這種方法也適合于實踐應用中。而后來大量的研究結果也證實了其所具備的可參考價值，并且應用于圖2不同菌系透明圈直徑與菌落直徑對比圖的實際操作中[10]。根據表2中的測量結果對比可以初步判斷不同菌系產纖維素酶活力的大小為：④＞⑥＞①≈②＞⑤≈⑦＞③。

2.2 纖維素降解菌的復篩

2.2.1 葡萄糖標準曲線的測定

圖3為葡萄糖標準曲線圖。

2.2.2 不同菌株的酶活力大小測定

能夠將纖維素水解生成葡萄糖的一系列酶被統稱為纖維素酶，為包含多種功能相似酶的復合酶系的統稱。根據纖維素酶在作用過程中催化的功能和性質差異，可基本將其分為三類：內切β-1,4-葡聚糖苷酶或稱Cx酶即為CMC酶，外切β-1,4-葡聚糖苷酶也可稱為C1酶，以及β-葡萄糖苷酶[11]。

纖維素酶對纖維的降解機理有好多種說法，其中一種C1-Cx假說認為，在纖維素的水解過程中CMC酶起到至關重要的作用，不僅如此，CMC酶對纖維素大分子水解生成纖維二糖和三糖的過程也有很大影響，因此其可以作為纖維素酶能力強弱的一個重要判斷依據[12]。

而纖維素酶在以濾紙條為底物進行降解時所體現出的酶活性被稱為FPA酶活力，因濾紙中的纖維素結構較松散的結晶度和聚合度，使其較容易被降解利用，故FPA酶活力一般可視作一個纖維素酶系的總酶活力大小判斷依據，不同酶系之間的協同作用大小既是通過FPA酶活力體現的。將初篩所取得的7種菌系分別接種到CMC-Na液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，測定纖維素酶活。

7種菌系酶活力大小如圖4、圖5所示。根據兩圖顯示結果可知不僅不同種菌株產生的同一種酶活力之間存在不同，而且同一種菌株產生不同酶的能力大小也存在差異。而纖維素的降解過程是在多種酶的協同參與下完成的，由于單一的菌株所產酶的功能和性質都具有一定的局限性，所以不能靠單一的菌種來提供降解纖維素的全部酶系。所以為了進一步實現高效降解纖維素的目標，需要結合不同功能比較強的酶協同作用。故結合圖2中透明圈直徑與菌落直徑的比值對比以及圖4、圖5中對不同菌系酶活的大小比較可得出④號酶系的綜合能力較強，能夠用來與化學法預處理組進行進一步的秸稈降解。

圖4 不同菌系CMC酶活力比較

圖5 不同菌系FPA酶活力比較

2.3 降解工藝的確定

④號jw-1和jw-2復合菌系與不同濃度酸、堿預處理組結合降解后各組的失重率如圖6、圖7所示，由兩圖可知復合菌系與10% NaOH降解效果最佳，失重率可達76.8%。故選定10% NaOH預處理結合木霉jw-1與jw-2復合菌系為降解玉米秸稈效果最優(yōu)工藝。

圖6 不同濃度NaOH預處理組失重率

圖7 不同濃度冰乙酸預處理組失重率

3 結論

研究結果表明，在復合菌系的構建中，通過對透明圈與菌落直徑比值大小的對比可知，木霉jw-1與木霉jw-2產纖維素酶能力較高，透明圈與菌落直徑比可達到1.8，而通過CMC酶活與FPA酶活大小的比較可得出jw-1與jw-2產纖維素酶活力最高，CMC酶活為2.76 U/mL，FPA酶活為1.52 U/mL；在化學預處理與菌系結合降解工藝的篩選中，10% NaOH與 jw-1和 jw-2復合菌系結合降解效果最好，降解率可達76.8%。

與前人研究結果相比，本實驗在化學法預處理中得出添加10% NaOH溶液對秸稈預處理降解效果最好的結論，這與李軼等[6]在試驗中添加10% NaOH溶液后加入綠色木霉的處理方式對秸稈木質素的降解效果較好且降解率達到39.28%的研究結果一致。本研究意在利用兩株纖維素酶高產菌優(yōu)化預處理工藝，并取得了可靠的分析結果。在復合菌系的構建中，將3種纖維素酶產量高的菌種進行混合篩選，并且最佳工藝降解效率達到了76.8%，與單一菌種處理相比提高了1.9倍。但對于處理原材料的選擇方面，本研究僅選取玉米秸稈作為實驗原材料，可在以后的研究中適當增加材料的選取種類，對其他農作物秸稈進行有關研究，以便更好的發(fā)揮其實際應用價值。