劉 益，胡韋維 綜述，張鵬輝 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科 400014)

異基因造血干細胞移植(HSCT)是目前根治遺傳性、惡性血液系統(tǒng)疾病的最重要的手段，然而配型成功率低、易發(fā)生急性移植物抗宿主病嚴(yán)重限制了其在臨床治療中的廣泛應(yīng)用。誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)具有細胞來源廣、可直接從患者自身獲得、在體外可誘導(dǎo)分化為造血祖細胞的優(yōu)點。隨著基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，靶向修復(fù)患者iPSCs從而治療遺傳疾病已成為可能。本文就iPSCs在遺傳性血液病中的研究進展作一綜述。

1 iPSCs技術(shù)

干細胞是指一類具有自我更新能力與多向分化潛能的原始未分化的細胞群體，因其具有多向分化潛能，自其發(fā)現(xiàn)以來便備受臨床研究、再生醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，將已分化的體細胞通過重編程技術(shù)，使其重回干細胞狀態(tài)，一直是國內(nèi)外科學(xué)研究熱點。目前常用的重編程技術(shù)有3種：核移植(NT)、細胞融合、iPSCs技術(shù)。iPSCs技術(shù)是新近發(fā)明的重編程技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于細胞治療、藥物篩選、毒理測試和研究疾病機制中。它具有細胞來源廣、可直接從患者體細胞中獲得的優(yōu)點，避免了倫理問題和免疫排斥反應(yīng)。伴隨基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，以用iPSCs為基礎(chǔ)，進行基因靶向修飾日趨成熟。

2007年TAKAHASHI等[1]通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc(OSKM因子)4種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入人成纖維細胞中，獲得了一種在形態(tài)、增殖能力、表面抗原、端粒酶活性及干細胞相關(guān)基因表觀遺傳狀態(tài)均與胚胎干細胞相似的細胞，即iPSCs。隨著研究不斷深入，皮膚成纖維細胞、角質(zhì)層細胞、小腸上皮細胞、神經(jīng)肝細胞、外周血單個核細胞、肝細胞、胰腺β細胞等已被證實可重編程為iPSCs；同時Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4種轉(zhuǎn)錄因子可以被其他因子如Tet1、Sox3、I-Myc等替代[2-4]。去除高致癌的c-Myc，僅用Oct4、Sox2、Klf4 3種轉(zhuǎn)錄因子也可將體細胞誘導(dǎo)為iPSCs[5]。而更安全、便捷的化學(xué)小分子介導(dǎo)的體細胞誘導(dǎo)重編程技術(shù)也在小鼠內(nèi)、中、外胚層細胞中取得成功[6-7]。為iPSCs治療人類疾病奠定了理論基礎(chǔ)。

2 iPSCs在遺傳性血液病中的應(yīng)用

遺傳性血液病是由遺傳因素導(dǎo)致骨髓造血功能紊亂的疾病，造血干細胞移植是目前根治遺傳性血液病的重要手段，然而其來源有限、風(fēng)險極大，臨床上常以對癥支持治療為主，大大降低了患者的生存年限和生活質(zhì)量。iPSCs的出現(xiàn)為遺傳性血液病的治療帶來了新思路，下面以范可尼貧血、鐮刀型細胞貧血病、地中海貧血為代表，簡述iPSCs在遺傳性血液病中的應(yīng)用。

2.1范可尼貧血(FA) FA是一種先天性再生障礙性貧血，屬于常染色體隱性遺傳病，患者體細胞對DNA交聯(lián)劑異常敏感，易發(fā)生染色體斷裂，致骨髓造血功能衰竭，出現(xiàn)全血細胞減少，常伴有先天性骨骼、心臟等畸形。長期以來敲除FA基因的小鼠無法表現(xiàn)出人類骨髓三系下降的表型。2009年RAYA等[8]將包含VAV啟動子的失活慢病毒轉(zhuǎn)入FA患者的成纖維細胞中進行基因修復(fù)，并把包含OSKM 4種轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入修復(fù)后的細胞中成功獲得了FA-iPSCs，同OP9細胞共培養(yǎng)后得到表型正常的紅系和髓系造血祖細胞，F(xiàn)A-iPSCs及分化成紅系或髓系造血祖細胞仍保留對DNA交聯(lián)劑敏感的特點，然而該實驗證實iPSCs不能直接從FA患者體細胞誘導(dǎo)獲得，必須先將患者體細胞進行修復(fù)后方可成功誘導(dǎo)。隨后，MUELLER等[9]證明低氧狀態(tài)下FA患者的體細胞可不經(jīng)基因修復(fù)直接誘導(dǎo)成iPSCs。OSBORN等[10]設(shè)計了針對FA基因15號外顯子1461C>A的sgRNA，利用CRISPR/Cas9修補患者的iPSCs，并證實該位點同源重組修復(fù)(HDR)概率高于非同源重組修復(fù)(NHEJ)，保證了基因編輯技術(shù)治療FA的精確性與安全性，為將來應(yīng)用iPSCs聯(lián)合基因修復(fù)技術(shù)治療該病奠定基礎(chǔ)。

2.2鐮刀型細胞貧血病(SCD) SCD是由點突變引起β珠蛋白第6位谷氨酸被纈氨酸替代，導(dǎo)致血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常，該病在世界范圍內(nèi)分布廣泛，具有高的致死性和發(fā)病率。2007年，HANNA等[11]將來自人源性SCD小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)成iPSCs，電轉(zhuǎn)正常β珠蛋白基因至iPSCs后，利用擬胚體(EB)技術(shù)將其分化為造血祖細胞，再注入回SCD小鼠中，最終在小鼠體內(nèi)檢測到正常β珠蛋白基因表達。ZOU等[12]將包含了藥物篩選位點的loxP序列和錨定突變位點的鋅指核酸酶(ZFN)序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SCD患者(βS/βS)來源的iPSCs中，將1條突變的βS修復(fù)為正常的βA，得到了基因型為βA/βS的iPSCs，用Cre重組酶將loxP序列敲除并分化為紅細胞后，可得到25%～40%的正常βA表達。2016年LI等[13]找到一種更高效、安全的誘導(dǎo)SCD患者iPSCs方法，他們將EB病毒上的oriP/EBNA1區(qū)連致HDAd載體內(nèi)，解決了HDAd載體無法進行重編程的問題，后將包含Oct4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin-28、p53shRNA序列的HDAd/EBV載體導(dǎo)入敲除病毒編碼區(qū)的腺病毒中，降低了腺病毒的毒性和免疫活性，大幅度提高了誘導(dǎo)效率，利用CRISPR/Cas9技術(shù)將針對SCD的sgRNA、Cas9蛋白及HDR單鏈寡核酸修復(fù)模板(ssODN)注入iPS細胞系中，修復(fù)效率高達67.9%(βA/[βS+βA])。修復(fù)后的iPS細胞行全基因組測序未發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因或其他致病基因改變，這為修復(fù)患者來源的iPSCs提供了快速、高效、安全的方法，也為治療其他基因突變疾病奠定基礎(chǔ)。

2.3β-地中海貧血 β-地中海貧血是常見的遺傳疾病，由β珠蛋白基因的缺失或突變引起，正常β珠蛋白的減少致使血紅蛋白不能攜帶足夠氧氣滿足機體代謝需要，中間型、重型患者常需終生輸血、祛鐵治療。2009年，YE等[14]成功獲得了β-地中海貧血患者成纖維細胞來源的iPSCs，同時還將來自β-地中海貧血胎兒產(chǎn)前基因篩查的羊水或絨毛細胞誘導(dǎo)成iPSCs；最近，iPSCs也被證實可由β-地中海貧血患者的外周血或臍帶血細胞產(chǎn)生[15]，為日后治療胎兒重型地中海貧血提供了重要平臺。WANG等[16]用同源重組的方法修復(fù)了β-地中海貧血患者來源的iPSCs，將修復(fù)后的iPSCs定向分化為造血祖細胞并注入免疫缺陷鼠中，成功檢測到人正常β珠蛋白表達。MA等[17-18]先后應(yīng)用轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)和ZFN技術(shù)修復(fù)了β-地中海貧血患者iPS細胞株上β-珠蛋白的基因突變，修復(fù)后的iPSCs仍具有正常核型與多向分化能力，同OP9系統(tǒng)共培養(yǎng)后可向紅系分化，應(yīng)用外顯子測序技術(shù)檢測ZFN修復(fù)前、修復(fù)后及向造血祖細胞分化時的β-地中海貧血iPSCs發(fā)現(xiàn)，基因突變多發(fā)生于重編程和基因修復(fù)過程中，與iPSCs的傳代次數(shù)和培養(yǎng)時間無關(guān)。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，iPSCs技術(shù)與CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合治療β-地中海貧血相關(guān)研究被不斷報道，LIU等[19]應(yīng)用CRISPR/Cas9聯(lián)合小分子化合物修正β-地貧iPSCs突變的β-珠蛋白基因，在保證修正后細胞保持正常核型與完全多能性的同時，提高了修正效率且無脫靶作用，為應(yīng)用CRISPR/Cas9聯(lián)合iPSCs治療血紅蛋白病提供了新方法。XIE等[20]將CRISPR/Cas9與piggyBac技術(shù)相結(jié)合，在修復(fù)β-地貧iPSCs后不殘留基因痕跡，為未來應(yīng)用iPSCs治療地中海貧血提供了有力依據(jù)。

3 展 望

iPSCs技術(shù)為治療血液系統(tǒng)疾病的提供了新的方向，但將其投入臨床治療尚需克服很多難關(guān)。首先，分化后的靶細胞移植入體內(nèi)后其分化方式和分化機制仍有待研究，同時iPSCs也存在著誘導(dǎo)效率低和安全性問題。隨著研究的進一步深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過程中表達細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白依賴性激酶1、抑癌基因p53、細胞周期調(diào)節(jié)基因INK4A抑制劑和某些特定的miRNA可提高誘導(dǎo)效率，而與體細胞相比，成體干細胞更易轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細胞[21-23]。同時，細胞因子載體也由最初的逆轉(zhuǎn)錄病毒改為更安全的腺病毒、仙臺病毒、質(zhì)粒等。近年來，降低外源基因隨機整合的實驗方法也獲得了成功，相信隨著對重編程過程和表觀遺傳狀態(tài)研究的逐步加深，人們可以找到更安全、高效的誘導(dǎo)方法[24]。iPSCs技術(shù)與基因編輯技術(shù)、基因表達調(diào)控技術(shù)相結(jié)合后將為遺傳性血液病的治療開啟新的篇章。