莊向婷，白 軍，張振倉

（楊凌職業(yè)技術(shù)學院，陜西 楊凌 712100）

隨著生命醫(yī)學和科學技術(shù)的快速發(fā)展，基于分子生物學技術(shù)對病原體進行測定的分子診斷技術(shù)，大大提高了動物病原體的檢測水平，從分子水平探討疾病發(fā)生和發(fā)展的機制，為動物疫病的預防、診斷和治療提供信息和決策的依據(jù)。分子診斷技術(shù)發(fā)展至今，主要分為傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)（核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應技術(shù)和限制性酶切技術(shù)等）和新型分子診斷技術(shù)（實時熒光PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)和核酸擴增技術(shù)等）。近些年來，一些新型分子診斷技術(shù)逐步實現(xiàn)了分子檢測的自動化和高通量，并應用于動物疫病診斷，有效提高了疫病確診速度與準確性，為及時控制疫情提供了決策依據(jù)。該文就目前所應用的幾類新型分子診斷技術(shù)在動物疫病檢測中的原理及實踐應用進行簡單介紹和評論，并對其發(fā)展趨勢與前景作出展望。

1 新型分子診斷技術(shù)在病原檢測中的分類及應用

病原體的檢測是動物疫病確診的基石，對采取防控措施、提高療效、改善預后、降低費用有著極其重要的作用。但是某些病原體造成的傳染病感染部位深、數(shù)量少、采樣困難，在臨床實驗室病原微生物培養(yǎng)條件下，增長緩慢或難以培養(yǎng)，導致檢出率不高。傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)又存在操作步驟繁瑣、工作量大、周期長等不足，無法滿足臨床早期、快速診斷以及治療、防控疾病的需要。隨著分子檢測技術(shù)的逐步發(fā)展，許多新型的分子診斷技術(shù)具有效率高、特異性強、敏感性高等優(yōu)勢，在傳染性疫病檢測領(lǐng)域的應用逐漸成熟。

1.1 實時熒光PCR技術(shù)

Higuchi于1992年提出實時觀測PCR反應整個過程的構(gòu)想。基于普通的PCR反應，在進行核酸擴增的過程中，摻入到雙鏈核酸中的熒光基團或者熒光染料隨著每一次的擴增循環(huán)嵌入釋放熒光，通過對所釋放出的熒光強度實時檢測，并結(jié)合相應的計算方法，從而得出待檢測樣品中目標基因的含量，實現(xiàn)了PCR由傳統(tǒng)的定性到定量測定的轉(zhuǎn)化[1-2]。1995年美國應用生物系統(tǒng)公司研制的首臺熒光定量PCR儀使熒光定量PCR技術(shù)走向市場化，在醫(yī)學、檢驗檢疫等方面得到了快速的推廣應用。

1.1.1 水解探針法：TaqMan熒光探針是特異性的寡核苷酸熒光探針，在兩端標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。在探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收而檢測不到熒光。在PCR擴增時，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針降解使得熒光基團分離，釋放出熒光信號。目標基因每擴增一次就會有一個熒光基團游離出來，從而實現(xiàn)熒光的逐步積累，進而進行PCR產(chǎn)物的定量測定。新型的TaqMan-MGB探針在3′端使用了無熒光的淬滅基團，本身不產(chǎn)生熒光，大大降低了本底信號的強度。同時3′端的小分子修飾基團使得探針的長度縮短，可將探針的Tm值提高10℃，對單堿基突變的檢測靈敏性得到提高。TaqMan-MGB實時熒光定量分析法能夠快速、準確地定量測定出目標基因，且靈敏度高，特異性強，干擾因素少。

TaqMan技術(shù)已經(jīng)在病原體檢測、鑒別，畜禽產(chǎn)品的檢驗、檢疫以及疫苗效力的測定上得到了較為廣泛的應用。如Dovas等[3]建立了對H5N1禽流感病毒的實時熒光定量PCR測定方法，適用于H5N1禽流感病毒的高通量檢測，并可在臨床對疫病進行快速檢測、診斷與推廣。曹偉偉等[4]通過對基因儲存庫中豬圓環(huán)病毒的基因序列進行比較后，設(shè)計出能夠特異性檢測豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的引物，成功建立了PCV-2的TaqMan實時熒光定量檢測方法，該方法特異性高，能夠為PCV-2的防治提供快速的指導。何世成等[5]建立了采用雙重熒光RT-PCR技術(shù)來鑒別小反芻獸野毒與疫苗毒的區(qū)分方法，該方法檢測流程簡單，重復性好，靈敏度高，節(jié)約成本，更為便捷，且可以將診斷時間縮短至1 h便可快速區(qū)別出野毒株和疫苗株，為小反芻獸疫的流行病學調(diào)查、感染監(jiān)測和疫苗評估提供快速有力的依據(jù)。

1.1.2 雜交探針法：分子信標探針的本質(zhì)是莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，所標記的熒光基團和淬滅基團因兩端的核酸互補配對而緊緊靠近。在PCR擴增過程中，模板通過與特異性靶序列雜交而發(fā)生構(gòu)象變化，使得熒光基團與淬滅基團分開。熒光基團被激發(fā)后，發(fā)出激發(fā)光子，熒光強度隨著擴增產(chǎn)物的增加而積累，通過熒光儀的檢測進行基因的定量分析。分子信標技術(shù)目前已用于單核苷酸多態(tài)性檢測、病原體檢測等生物醫(yī)學和臨床研究領(lǐng)域。McKillen等[6]建立的分子信標熒光定量PCR技術(shù)能夠快速鑒別非洲豬瘟（ASFV）病原體，對于目標基因最低可檢測到2×101的復制。該方法能夠在同一個反應過程中通過不同的熒光探針進行多目標的檢測，如同時快速、靈敏地進行豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）與豬細小病毒（PPV）的鑒別測定，為正確實施疫病防控措施提供了有效保障。

羅氏公司開發(fā)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）探針又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針，由2條和模板互補且相鄰的特異探針組成，是距離很近的2個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。FRET探針復性時，2條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測信號；升溫變性時，兩探針游離，兩基團距離較遠而檢測不到熒光信號，所以檢測的是實時信號，是可逆的，可以進行熔解曲線的分析，還可以用于突變分析以及產(chǎn)物鑒別。此外，采用2條模板特異的探針，在檢測過程中不受非特異性產(chǎn)物的影響，因而專一性更高于傳統(tǒng)的PCR檢測方法。歐盟的合作實驗室利用FRET技術(shù)建立了同時檢測口蹄疫所有7種血清型的定量實時RTPCR，測定靈敏度高，準確性高。1.1.3 熒光引物：Amplifluor技術(shù)的基本原理是激發(fā)的熒光進行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導致熒光發(fā)射的淬滅。目標特異性Amplifluor引物包含一個5′內(nèi)部互補序列，標記有熒光發(fā)色團和一個能量受體：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。3′端序列是目標特異性引物區(qū)，Amplifluor引物由于內(nèi)部熒光發(fā)色團和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號。在PCR擴增循環(huán)過程中，Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產(chǎn)生熒光信號。根據(jù)擴增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號的強度與擴增產(chǎn)物的量進行定量分析。

由Invitrogen公司建立的LUM（light upon extention）技術(shù)采用類似分子信標的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計引物，使引物同時起到熒光探針的作用。該技術(shù)不需要專門設(shè)計探針，因此可以節(jié)約成本，同時為實驗設(shè)計提供了寬松的條件。李軍等[7]設(shè)計的熒光雙鏈引物是利用2條完全互補的寡聚核苷酸雜交形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，將其中一條用于標記PCR擴增的引物，稱為“正引物”，另一條與正引物完全互補，稱為“負引物”。該方法應用于雞新城疫的檢測，成本低、特異性與重復性好，并能夠準確定量樣品中的基因拷貝數(shù)，在臨床診斷、出入境檢驗檢疫中有著廣闊的應用前景。

1.2 基因芯片技術(shù)

20世紀80年代末，采用雜交法測定核酸序列的想法被提出，經(jīng)過生物醫(yī)學基礎(chǔ)學科的快速發(fā)展，使基因芯片技術(shù)得到了推進與應用。基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和核酸雜交技術(shù)之上，利用PCR技術(shù)制備檢測模板，采用原位合成或顯微點樣技術(shù)將大量核酸片段探針有序地固化于支持物表面，然后與標記的待檢測靶基因片段雜交，通過對雜交信號的強度與分布進行檢測和分析，從而獲得樣品的基因序列、含量、基因表達等。高密度基因芯片可以預先設(shè)計大量探針固定于載體上，同時對成千上萬個樣品進行檢測，實現(xiàn)樣品的高通量檢測，縮短了實驗進程，提高了檢出率。在統(tǒng)一設(shè)置的條件下，設(shè)置多種熒光標記探針，對多個樣品同時分析，減少了外界因素的干擾，從而提高檢測的準確性。此外，基因芯片技術(shù)可以實現(xiàn)實時、快速的全自動檢測分析和高精密度、高靈敏度分析。

秦智鋒等[8]利用 39個目的片段，同時加入λDNA作為坐標基因制備的基因芯片，可對臨床上癥狀相似的4種水皰性疾病進行快速大批量的鑒別診斷。楊素等[9]利用分子克隆的方法分別獲得口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、藍舌病病毒、鹿流行性出血熱病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段，將其固化在包被過的玻璃片上，制備成檢測芯片，實現(xiàn)了對該5種病毒的快速有效診斷。該方法檢測效率高，特異性強，靈敏度高，可應用于對多種動物傳染病的大規(guī)模篩檢、快速檢測和鑒別診斷，尤其是可用于進出境動物檢驗檢疫。此外，基因芯片技術(shù)還被應用于細菌分型的鑒定及耐藥性的測定[10]?；蛐酒夹g(shù)有高通量、多參數(shù)、高靈敏度與自動化的優(yōu)點，但同時由于設(shè)備昂貴、基因芯片技術(shù)標準化、成本高，以及待測靶探針標記方法繁瑣等問題，目前其在動物疫病檢測方面的應用還受到一定的制約，隨著技術(shù)的不斷完善和成熟，檢測設(shè)備低廉化以及操作程序簡約化，將來會為動物疫病檢測帶來更大的飛躍。

1.3 核酸恒溫擴增技術(shù)

核酸恒溫擴增技術(shù)是將PCR擴增反應過程進行恒溫控制的一種新型擴增技術(shù)。相對于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，該反應對儀器設(shè)備的要求簡化，同時反應時間大幅縮短，反應結(jié)果肉眼可見。由于該技術(shù)潛在的巨大應用前景促使了多種不同形式的恒溫擴增技術(shù)的產(chǎn)生。

2000年 Notomi等[11]建立了環(huán)介導恒溫擴增法（LAMP），通過識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、特異地擴增靶序列。LAMP在反應過程中，能夠產(chǎn)生大量的白色焦磷酸鎂沉淀，而且可以通過焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生量與DNA生成量之間的線性關(guān)系，對整個反應進行定量。Dukes等[12]采用RT-LAMP方法快速檢測口蹄疫病毒，能夠在22 min內(nèi)便可得到檢測結(jié)果，且可以檢測到僅10個拷貝的口蹄疫病毒。Imai等[13]利用RTLAMP建立了針對H5亞型的高致病性禽流感病毒的檢測方法，該方法的敏感性是傳統(tǒng)PCR的100倍。Chen等[14]建立了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RT-LAMP檢測方法，與RT-PCR檢測手段相比，該方法更靈敏、更可靠、更便捷。

Compton[15]于 1991 年在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上提出了核酸擴增技術(shù)（NASBA），目前該技術(shù)已經(jīng)相對成熟地應用于病原體與基因異常的檢測、動物疫病診斷等領(lǐng)域當中。Collins等[16-18]所建立的NASBA技術(shù)可以對口蹄疫的血清型進行檢測，且實現(xiàn)了H7型禽流感的快速檢測，并通過改良使其能夠鑒別出高致病性禽流感和低致病性禽流感。我國2004年發(fā)布的系列標準GB/T 19439—2004《H5亞型禽流感病毒NASBA檢測方法》和GB/T 19440—2004《禽流感病毒NASBA檢測方法》均采用NASBA檢測方法對禽流感病毒進行測定。

此外，建立在恒溫擴增基礎(chǔ)上的還有切口酶核酸恒溫擴增技術(shù) （NEMA）、轉(zhuǎn)錄酶擴增技術(shù)（TMA）、鏈置換擴增技術(shù)（SDA）、滾環(huán)擴增技術(shù)（RCA）、解旋酶擴增技術(shù)（HDA）、實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)（SAT）等，這些技術(shù)因存在成本高等問題，目前還處于研究階段。相信隨著儀器設(shè)備的升級、成本的降低、技術(shù)的完善，這些技術(shù)將會更便捷地應用于動物疫病的檢測中。

1.4 其他分子診斷技術(shù)

隨著學科的交叉，分子生物學的日新月異，越來越多的新技術(shù)與PCR技術(shù)進行結(jié)合，建立了實用效果越來越好的檢測技術(shù)，并已經(jīng)應用到動物疫病的檢測當中。

2010年馬艷琴[19]建立了PCR-斑點雜交技術(shù)，設(shè)計了豬源支原體PCR通用外套引物和豬肺炎支原體種特異性內(nèi)套引物及地高辛標記寡核苷酸探針，應用于豬瘟活疫苗中豬肺炎支原體污染的檢測，相對于套式PCR法，敏感性更好，檢出率提高了10%。程安春等[20]建立了原位PCR（ISPCR）技術(shù)，對石蠟切片中鴨病毒性腸炎病毒（DEV）核酸進行定位，該方法直觀、敏感、特異性強，在顯示核酸陽性信號的同時，還能判別含有靶序列的細胞類型以及組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與病理變化。楊利峰等[21]將PCR與免疫學技術(shù)聯(lián)用，建立了豬瘟RT-PCR ELISA診斷方法，克服了組織樣品中豬瘟病毒含量少而難以檢測的困難，為豬瘟的早期診斷和分子流行病學調(diào)查提供了一條新途徑。不同病原體診斷技術(shù)的相互聯(lián)用，進一步提升了診斷的準確性，為臨床疫病的確診與防治提供了決策依據(jù)。

2 新型分子診斷技術(shù)的發(fā)展趨勢與前景展望

動物疾病檢測的快速有效性在臨床疫病的防控中起著非常重要的作用。傳統(tǒng)的分子診斷技術(shù)，如核酸雜交技術(shù)、限制性酶切技術(shù)、核酸片段多樣性分析等，存在操作步驟繁瑣、周期長、成本高、有假陽性或假陰性結(jié)果呈現(xiàn)等缺點，在動物疫病診斷中的應用受到了一定的限制。隨著分子檢測技術(shù)的不斷進步，近年來建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的新型核酸診斷技術(shù)，具有敏感性高、特異性強、操作簡便、診斷快速等優(yōu)勢，已經(jīng)越來越多地被應用于動物疫病的檢測當中。

多重熒光PCR和生物芯片技術(shù)等技術(shù)實現(xiàn)了一次反應同時檢測多種病原的高效檢測，適用于混合感染和未知感染的篩查和快速診斷。隨著核酸提取、加樣檢測和分析等環(huán)節(jié)儀器裝置的自動化研制，使得樣品的處置量、提取的穩(wěn)定性和自動化程度提高。隨著儀器設(shè)備的研發(fā)，檢測成本的降低，技術(shù)成熟度的提高，適用于基層和現(xiàn)場使用的檢測技術(shù)將成為動物疫病檢測的一個發(fā)展趨勢。同時，結(jié)合其他的診斷技術(shù)，更多新型診斷方法使檢測的樣品數(shù)量和病原體種類更多，涉及領(lǐng)域也會不斷增加，動物的疫病檢測診斷將會更加快速、準確、全面。現(xiàn)代分子診斷技術(shù)不僅僅用于臨床診斷和鑒別診斷，其具有高通量、自動化、精密化等特點，在大范圍的流行病學調(diào)查和分析方面也能夠發(fā)揮巨大的優(yōu)勢，為動物疫病的傳播范圍和傳播途徑的研究提供支持，從而為動物疫病的科學防控奠定基礎(chǔ)。

[1]HIGUCHI R，DOLLINGER G，WALSH P S，et al.Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences[J].Bio/Technology，1992，10（4）：413-417.

[2]HIGUCHI R，F(xiàn)OCKLER C，DOLLINGER G，et al.Kinetic PCR analysis：real-time monitoring of DNA amplification reactions [J].Biotechnology （NY），1993，11（9）：1026-1030.

[3]DOVAS C I，PAPANASTASSOPOULOU M，GEORGIADIS M P，et al.Detection and quantification of infectious avian influenza A （H5N1） virus in environmental water by using real-time reverse transcription-PCR [J].Appl Environ Microbiol，2010，76 （7）：2165-2174.

[4]曹偉偉，郭抗抗，許信剛，等.豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Taq-Man實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2013，41（1）：13-18.

[5]何世成，鄒玖零，王衛(wèi)國，等.小反芻獸疫病毒野毒與疫苗毒雙重熒光RT-PCR鑒別檢測方法的建立[J].中國動物傳染病學報，2016，24（4）：31-35.

[6]McKILLEN J， HJERTNER B， MILLAR A， et al.Molecular beacon real-time PCR detection of swine viruses[J].J Virol Methods，2007，140（1/2）： 155-165.

[7]李軍，吳時友，尹燕博，等.雞新城疫病毒熒光雙鏈引物實時熒光PCR檢測方法的研究 [J].家畜生態(tài)學報，2006，27（4）：89-93.

[8]秦智鋒，鐘安清，楊寶華，等.用基因芯片鑒別診斷四種水泡性疾病[J].中國病毒學，2003，18（2）：174-177.

[9]楊素，花群義，徐自忠，等.口蹄疫等5種動物病毒基因芯片檢測技術(shù)的研究 [J].微生物學報，2004，44（4）：479-482.

[10]張輝，楊曉潔，張媛，等.基因芯片技術(shù)及其在病原微生物檢測和研究中的應用[J].動物醫(yī)學進展，2009，30（12）：100-104.

[11]NOTOMI T，OKAYAMA H，MASUBUCHI H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA [J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）： E63.

[12]DUKES J P，KING D P，ALEXANDERSEN S.Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus[J].Arch Virol，2006，151（6）：1093-1106.

[13]IMAI M，NINOMIYA A，MINEKAWA H，et al.Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method[J].J Virol Methods， 2007，141（2）：173-180.

[14]CHEN H T，ZHANG J，MA L N， et al.Rapid pre-clinical detection of classical swine fever by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification [J].Mol Cell Probes，2009，23（2）：71-74.

[15]COMPTON J.Nucleic acid sequence-based amplification[J].Nature，1991，350（6313）：91-92.

[16]COLLINS R A，KO L S，F(xiàn)UNG K Y，et al.A method to detect major serotypes of foot-and-mouth disease virus[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，297 （2）：267-274.

[17]COLLINS R A， KO L S，SO K L， et al.Detection of highly pathogenic and low pathogenic avian influenza subtype H5 （Eurasian lineage） using NASBA [J].J Virol Methods，2002，103（2）：213-225.

[18]COLLINS R A，KO L S，F(xiàn)UNG K Y，et al.Rapid and sensitive detection of avian influenza virus subtype H7 using NASBA [J].Biochem Biophys Res Commun，2003，300（2）：507-515.

[19]馬艷琴，鄭俊梅，張映.檢測疫苗中豬肺炎支原體污染的PCR-斑點雜交法和套式PCR法比較研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報，2010，15（3）：83-87.

[20]程安春，廖永洪，朱德康，等.檢測石蠟切片中鴨病毒性腸炎病毒間接原位PCR方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（12）：4365-4371.