丁鐘歡 綜述，盧忠心 審校

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院檢驗科，武漢 430000)

細(xì)胞是組成人體組織與器官的基本單位，通過細(xì)胞集合進行的研究通常會錯失很多重要信息，主要是由于細(xì)胞集合性研究反映的是這一細(xì)胞集體的平均水平，而單個細(xì)胞間表達的信息往往千差萬別。腫瘤細(xì)胞的突變狀態(tài)、表觀遺傳狀況以及相關(guān)蛋白的表達水平等重要信息可能只有一小部分甚至少數(shù)幾個細(xì)胞表達[1]。另外，很多能反映疾病狀態(tài)的珍貴細(xì)胞，如母體血胎兒細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的數(shù)量非常稀少，很容易被大量的背景細(xì)胞所干擾[2]。因此，近年來隨著個體化醫(yī)療的發(fā)展及二代測序技術(shù)的提高，單細(xì)胞分析逐漸受到關(guān)注。

單細(xì)胞分析即是通過相應(yīng)的技術(shù)對單個靶細(xì)胞進行分離提取，并通過全基因組擴增及二代測序等技術(shù)對靶細(xì)胞內(nèi)的基因組信息、蛋白信息進行分析的過程。通過單細(xì)胞分析，會將腫瘤進展過程中的細(xì)胞變化、單個CTC的遺傳狀態(tài)、細(xì)胞與細(xì)胞間的異質(zhì)性、利用胎兒細(xì)胞遺傳疾病等問題迎刃而解[2]。本文將從近年來單個細(xì)胞的分離與提取手段、全基因組擴增及下游組學(xué)分析等研究進展作一綜述。

1　單細(xì)胞的分離與提取

單個細(xì)胞的分離與提取是進行單細(xì)胞分析的前提條件。流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)細(xì)胞分離方法對單細(xì)胞的分離效果并不理想；近年來，有很多學(xué)者對單細(xì)胞的分離與提取方法進行了不斷地探索。新發(fā)展的方法是結(jié)合了幾種傳統(tǒng)方法的特點而建立的新方法。例如，CAMPTON等[3]于2015年報道的單個CTC的分離檢測系統(tǒng)-AccuCyte?-CyteFinder?系統(tǒng)將離心、染色、鏡檢、細(xì)胞挑選集于一體，大大提高了單細(xì)胞分離的效率。

另外，傳統(tǒng)方法的改進與發(fā)展也是近年來研究的熱點，很多方法是基于微流控芯片檢測方法的改進。如ZHANG等[4]利用油性小滴將細(xì)胞隔離為單個細(xì)胞，再與微流控芯片系統(tǒng)結(jié)合進行檢測，其單細(xì)胞的分離效率超過90%。ANTFOLK等[5]將分離CTC的聲動力分選富集芯片與介電電泳芯片結(jié)合成聯(lián)合式的微流控系統(tǒng)可用于單個CTC的檢測。還有ZHANG等[6]報道的“3D凝膠島”芯片芯片，ANTFOLK等[5]報道的不同組分結(jié)構(gòu)芯片，以及KIM等[7]報道的單細(xì)胞檢測芯片等都表明其對單細(xì)胞具有較好的分離效果。另外，也有免疫磁珠法的改進，如HUANG等[8]報道表明用微磁珠與微流控芯片結(jié)合的新方法能提高對CTC的捕獲效率，在癌細(xì)胞模型中的捕獲效率超過97%。也有人工細(xì)胞提取技術(shù)的改進，如YOSHINO等[9]首先將乙二醇二丙烯酸酯光聚合水凝膠與微陣列捕獲進行結(jié)合對單細(xì)胞進行分離和下游分析。KRONEIS等[10]報道的自動激光微分離法能準(zhǔn)確地分離特異性染色的單個靶細(xì)胞。此外，也有利用靶細(xì)胞的新特性或利用新技術(shù)進行單細(xì)胞分離的新方法，如DENG等[11]發(fā)現(xiàn)在封閉的小室內(nèi)用激光誘導(dǎo)前向轉(zhuǎn)移技術(shù)也能很好地對單個細(xì)胞進行分離。 CHEN等[12]利用微量吸管液體乳膠生成器生成很多乳糜狀的油性小滴，能將單個細(xì)胞包被在此環(huán)境中進行全基因組擴增和下游分析。

總的來說，這些研究均表明，可根據(jù)靶細(xì)胞的不同特性進行多種不同方法的單細(xì)胞分離，但是這些分離方法仍局限于實驗室探索階段，高效、特異、簡單的單細(xì)胞分離方法有待進一步的驗證。

2　單細(xì)胞信息分析

2.1全基因組擴增單細(xì)胞基因組DNA水平低至6 pg，每個基因只含有2個拷貝數(shù)，因此，利用普通方法進行單細(xì)胞基因組擴增與分析是不可行的[2]。目前為止，傳統(tǒng)的全基因組擴增方法主要包括點聚合酶鏈反應(yīng)(DOP-PCR)、多重置換擴增法(MDA)、多重退火及環(huán)式循環(huán)擴增法[2]。由于基因組覆蓋的廣度不同、鳥嘌呤與胞嘧啶堿基水平差異產(chǎn)生擴增偏倚、等位基因缺失、等位基因優(yōu)先擴增等因素會使這些全基因組擴增方法間存在明顯的差異，能影響下游的微陣列芯片及二代測序分析。

因此，近年來人們也在對全基因組擴增方法進行不斷的改進與探索。最近，CHEN等[13]的轉(zhuǎn)座子插入線性擴增法通過轉(zhuǎn)座子插入進行線性放大，DNA被含有T7啟動子的Tn5轉(zhuǎn)座子隨機片段化，T7啟動子允許線性擴增，該方法能在千堿基分辨率進行微拷貝數(shù)變異(CNA)、單核苷酸變異(SNV)的檢測。 PICHER等[14]報道了一種特殊的DNA聚合酶-TthPrimPol酶，具有比Phi29 DNA酶具有更強的聚合活性，利用該酶進行的多重置換擴增反應(yīng)比Phi29具有更廣的基因組覆蓋度及單核苷酸變異位點檢測能力。 LEUNG等[15]通過一種油性-MDA，能在納米級體積的基礎(chǔ)上進行高效的單細(xì)胞全基因組擴增。

總之，隨著單細(xì)胞，特別是CTC、循環(huán)胎兒細(xì)胞等珍貴細(xì)胞在臨床中扮演著越來越重要的角色，單細(xì)胞全基因組擴增技術(shù)逐漸受到重視，為下游測序及相應(yīng)基因組分析提供良好的基礎(chǔ)。

2.2單細(xì)胞基因組測序分析全基因組測序是篩查單細(xì)胞SNV及CNA的有效手段，是檢測拷貝數(shù)變異的有效工具。目前為止，大規(guī)模平行測序技術(shù)主要在2個平臺上進行檢測：Illumina公司的 HiSeq/MiSeq平臺以及Thermo Fisher Scientific公司的Ion Torrent測序平臺[16]。 HiSeq平臺因測序覆蓋度更廣及價格較為低廉而被更廣泛地使用。而Ion Torrent平臺則更傾向于靶向測序，是臨床上用于突變等檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。另外，不同類型變異的檢測所要求的測序深度不同；如單細(xì)胞拷貝數(shù)變異分析所要求的測序深度較淺，可低至0.1～2.0 ×，而單細(xì)胞單核苷酸變異的測序深度則較大，為30.0～50.0 ×[17]。

值得一提的是，在基因組中，外顯子雖然只占其全長的1%，卻包含了約85%疾病相關(guān)的變異位點，因此，外顯子組測序也十分重要。外顯子組測序只對外顯子進行富集、擴增，所以其相比全基因組測序能更加高效、更利于編碼序列的讀取。目前，幾種可用于單細(xì)胞外顯子建庫的方法包括NimbleGen′s SeqCap、Agilent SureSelect、 Illumina TruSeq 及Nextera Exome[18]。 CHILAMAKURI等[18]對這4種方法進行評估結(jié)果顯示，Illumina平臺能更高效地對編碼及翻譯區(qū)域的堿基進行讀取。此外，Nextera Exome技術(shù)結(jié)合了樣本準(zhǔn)備的簡化程序及TruSeq的富集程序，使DNA需要量更少、時間需求更短[19]。

2.3單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析在單細(xì)胞中，mRNA雖然水平較低，但也存在著上千個拷貝數(shù)，這使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析成為可能[2]。而mRNA需經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄為cDNA后經(jīng)PCR擴增后才能進行測序分析，因此，高效、無偏差地反轉(zhuǎn)錄是擴增、測序的先決條件。細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄本線性 RNA擴增法是最早被用于擴增轉(zhuǎn)錄組RNA的方法，促進了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的發(fā)展[20]。目前，主要有以下幾種改良的cDNA擴增法：全組PCR擴增法、3′末端擴增法及鏈開關(guān)介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄擴增[21]。另外，幾種新的RNA測序方法也在探索與發(fā)展中，其中包括：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本分析、單分子熒光原位雜交及熒光原位雜交RNA測序等[2]。

2.4單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析對了解細(xì)胞信號通路及細(xì)胞間的異質(zhì)性具有重要的作用。傳統(tǒng)的蛋白檢測方法例如凝膠電泳法、免疫測定法、層析法、質(zhì)譜法都需要大量的細(xì)胞作為標(biāo)本。因此，單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析的主要瓶頸在于單細(xì)胞內(nèi)及其只有少量的蛋白質(zhì)而缺乏有效的擴增方法[22]。最近，一些方法學(xué)的發(fā)展也能使單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析具有較好的靈敏度與特異度[2]。如LINDSTROM等[22]報道的以微流控芯片為基礎(chǔ)，發(fā)展的小型流式細(xì)胞儀能對少量細(xì)胞(100～1 000)進行分析。MELLORS等[23]的研究表明，通過加入毛細(xì)管電泳改進質(zhì)譜的方法使其靈敏度提升，能同時對單細(xì)胞中多達40項參數(shù)進行測量。 DENG等[24]報道顯示，的通過多聚賴氨酸標(biāo)簽結(jié)合微流控芯片的方法能有效對單個CTC細(xì)胞蛋白質(zhì)水平進行評估。即便如此，單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析僅僅是一個開端，更簡便、更靈敏的單細(xì)胞蛋白質(zhì)檢測方法與手段有待進一步的探索和研究。

3　小　　結(jié)

目前，單細(xì)胞的分離與提取方法仍未成熟，近年來探究的方法常以各種傳統(tǒng)方法相結(jié)合、傳統(tǒng)方法的改進以及利用新特性等方式為主；全基因組擴增的發(fā)展為單細(xì)胞基因組及轉(zhuǎn)錄組序列分析奠定了良好的基礎(chǔ)；單細(xì)胞蛋白質(zhì)表達分析為細(xì)胞間通路及其相互作用提供了條件；完善單細(xì)胞分離、提取手段及信息分析方法對研究細(xì)胞間異質(zhì)性及稀有細(xì)胞用于疾病診斷等方面具有重要的意義。

[1]鄭磊,陳靜.循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測新進展及臨床價值[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2016,39(8):565-567.

[2]HU P,ZHANG W,XIN H,et al.Single cell isolation and analysis[J].Front cell Dev Bio,2016，4:116-124.

[3]CAMPTON D E,RAMIREZ A B,NORDBERG J J,et al.High-recovery visual identification and single-cell retrieval of circulating tumor cells for genomic analysis using a dual-technology platform integrated with automated immunofluorescence staining[J].BMC Cancer,2015,15(1):360.

[4]ZHANG Q,WANG T,ZHOU Q,et al.Development of a facile droplet-based single-cell isolation platform for cultivation and genomic analysis in microorganisms[J].Sci Rep,2017,7:41192-41198.

[5]ANTFOLK M,KIM S H,KOIZUMI S,et al.Label-free single-cell separation and imaging of cancer cells using an integrated microfluidic system[J].Sci Rep,2017,7:46507-46518.

[6]ZHANG Z,CHEN Y C,CHENG Y H,et al.Microfluidics 3D gel-island chip for single cell isolation and lineage-dependent drug responses study[J].Lab Chip,2016,16(13):2504-2512.

[7]KIM J,CHO H,HAN S I,et al.Single-cell isolation of circulating tumor cells from whole blood by lateral magnetophoretic microseparation and microfluidic dispensing[J].Anal Chem,2016,88(9):4857-4863.

[8]HUANG Y Y,CHEN P,WU C H,et al.Screening and Molecular Analysis of Single Circulating Tumor Cells Using Micromagnet Array[J].Sci Rep,2015,5:16047-16053.

[9]YOSHINO T,TANAKA T,NAKAMURA S,et al.Manipulation of a single circulating tumor cell using visualization of hydrogel encapsulation toward single-cell whole-genome amplification[J].Anall Chem,2016,88(14):7230-7237.

[10]KRONEIS T,CHEN S,EL-HELIEBI A.Low-volume on-chip single-cell whole genome amplification for multiple subsequent analyses[J].Methods Mol Biol,2015,1347(1):245-261.

[11]DENG Y,RENAUD P,GUO Z,et al.Single cell isolation process with laser induced forward transfer[J].J Biol Eng,2017,11(1):2-10.

[12]CHEN Z,FU Y,ZHANG F,et al.Spinning micropipette liquid emulsion generator for single cell whole genome amplification[J].Lab Chip,2016,16(23):4512-4516.

[13]CHEN C,XING D,TAN L,et al.Single-cell whole-genome analyses by linear amplification via transposon insertion (LIANTI)[J].Science,2017,356(6334):189-194.

[14]PICHER A J,BUDEUS B,WAFZIG O,et al.TruePrime is a novel method for whole-genome amplification from single cells based on TthPrimPol[J].Nat Commun,2016,7:13296.

[15]LEUNG K,KLAUS A,LIN B K,et al.Robust high-performance nanoliter-volume single-cell multiple displacement amplification on planar substrates[J].Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(30):8484-8489.

[16]ZHANG X,MARJANI S L,HU Z,et al.Single-Cell sequencing for precise cancer research:progress and prospects[J].Cancer research,2016,76(6):1305-1312.

[17]SIMS D,SUDBERY I,ILOTT N E,et al.Sequencing depth and coverage:key considerations in genomic analyses[J].Nat Rev Genet,2014,15(2):121-132.

[18]CHILAMAKURI C S,LORENZ S,MADOUI M A,et al.Performance comparison of four exome capture systems for deep sequencing[J].BMC Genomics,2014,15(1):449.

[19]LIU N,LIU L,PAN X.Single-cell analysis of the transcriptome and its application in the characterization of stem cells and early embryos[J].Cell Mol Life Sci,2014,71(14):2707-2715.

[20]PAN X.Single cell analysis:from technology to biology and medicine[J].Single Cell Biology,2014,3(1):106-123.

[21]沈燚昀,齊謝敏,宋沁馨,等.單細(xì)胞蛋白定量檢測方法研究進展[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2015,46(5):521-531.

[22]LINDSTROM S,ANDERSSON-SVAHN H.Overview of single-cell analyses:microdevices and applications[J].Lab Chip,2010,10(24):3363-3372.

[23]MELLORS J S,JORABCHI K,SMITH L M,et al.Integrated microfluidic device for automated single cell analysis using electrophoretic separation and electrospray ionization mass spectrometry[J].Anal Chem,2010,82(3):967-973.

[24]DENG Y,ZHANG Y,SUN S， et al.An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells[J].Sci Rep,2014,4:7499-7454.