趙 平，余 琴，張 喻，陳 亮

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院醫(yī)學檢驗科/尿液細胞分子診斷北京市重點實驗室 100038；2.北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病門診部 100029)

目前，結(jié)核病仍然是世界范圍內(nèi)致死率較高的傳染病。2015年，全世界大約有1 040萬人新發(fā)結(jié)核病，140萬人死于結(jié)核病[1]。我國是全球結(jié)核病高負擔國家之一，結(jié)核病患者數(shù)居世界第二位，并且占全球病例數(shù)的11%，2015年的發(fā)病人數(shù)估計在91.8萬人[1-2]。缺乏準確、快速的結(jié)核分枝桿菌檢測方法是結(jié)核病治療管理方面的主要障礙。目前我國結(jié)核病防治所和一些綜合醫(yī)院主要依靠痰涂片檢查抗酸菌和羅氏固體培養(yǎng)并結(jié)合患者臨床癥狀和X線表現(xiàn)來診斷肺結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)被認為是最終診斷的“金標準”，但是培養(yǎng)耗時較長，一般2～8周出結(jié)果。盡管痰涂片萋-尼氏染色顯微鏡檢查抗酸菌是一種快速并且廉價的檢測方法，但是其敏感性較差[3]。因此，依賴于核酸擴增技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌快速檢測對患者的早期治療，改善患者預(yù)后以及進行有效的公共衛(wèi)生干預(yù)都非常重要[4]。近幾年，多種分子生物學方法已經(jīng)被用于結(jié)核病的診斷和結(jié)核分枝桿菌耐藥的快速檢測，包括線性探針試驗、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和GeneXpert MTB/RIF技術(shù)等。但是，在我國分子生物學技術(shù)檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌還不是一線檢測方法，其檢測效能還需進一步確定。本研究對GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在診斷肺結(jié)核方面的能力進行評估，探討其在基層實驗室的應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1-6月來北京市朝陽區(qū)結(jié)核病門診就診的疑似肺結(jié)核患者治療前的痰標本240份，每份標本3～5 mL，其中112份來自女性患者，128份來自男性患者，患者年齡16～78歲，中位年齡為36.5歲，疑似肺結(jié)核患者的診斷按照《肺結(jié)核診斷標準(WS288-2008)》執(zhí)行。

1.2儀器與試劑 光學顯微鏡(Olympus，CX31RBSF)、萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，BASO)、BACTEC MGIT 960 結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)(M960,Becton Dickinson and Company，Sparks，Maryland，USA)、GeneXpert檢測系統(tǒng)和檢測試劑盒(Cepheid,Inc,Sunnyvale,CA,USA)。

1.3方法

1.3.1涂片、染色及鏡檢 每份痰標本先進行涂片，并對涂片進行萋-尼染色，光學顯微鏡下檢查抗酸桿菌。涂片、染色及鏡檢方法按《現(xiàn)代結(jié)核病診斷技術(shù)》[5]方法操作。

1.3.2培養(yǎng)及藥敏試驗 涂片后的每份痰標本被分為兩份，一份用L-半胱氨酸氫氧化鈉法進行去污染處理[6]。處理后的標本接種在M960液體培養(yǎng)基中，放在M960系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)方法參照儀器說明書進行。培養(yǎng)陽性的菌株用M960系統(tǒng)進行異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇的敏感性試驗，方法參照試劑盒說明書。于此同時，陽性菌株接種在對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基上進行初步的菌種鑒定。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF試驗 另一份標本按照文獻[7-8]及產(chǎn)品說明書進行GeneXpert MTB/RIF試驗。即用2.0 mL 的GeneXpert MTB/RIF樣本處理液加入到含1 mL痰標本的無菌離心管中，室溫靜置15 min，期間手動震蕩離心管2次，取處理后的標本2.0 mL 加入到測試盒中，將測試盒放入到儀器內(nèi)進行檢測。

1.3.4質(zhì)量控制 在每批次痰標本進行涂片染色鏡檢時，以卡介苗菌液涂片為陽性質(zhì)控，以大腸埃希菌菌液涂片為陰性質(zhì)控，陰性和陽性質(zhì)控片各1張。每批次結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗均使用標準敏感菌株H37Rv進行質(zhì)控檢測。 GeneXpert MTB/RIF法每個測試進行樣品處理質(zhì)量控制(SPC)和探針檢查質(zhì)量控制(PCC)，同時對H37Rv菌株進行檢測。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用χ2檢驗對涂片、培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)的檢驗效能進行比較分析，一致性檢驗采用Kappa檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)控結(jié)果 每批次卡介苗菌液涂片抗酸染色均陽性，大腸桿菌菌液涂片抗酸桿菌染色均陰性；H37Rv質(zhì)控菌株培養(yǎng)均陽性，異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素的藥敏試驗均敏感；GeneXpert MTB/RIF試驗在檢測標本時有1份標本出現(xiàn)質(zhì)控無效，造成檢測結(jié)果失敗，每批次檢測H37Rv時DNA檢測均陽性，利福平藥敏試驗結(jié)果均為敏感。

2.23種方法陽性檢出情況 痰涂片鏡檢陽性率為18.8%(45/240)，M960培養(yǎng)陽性率為33.8%(81/240)，GeneXpert MTB/RIF陽性率為36.3%(87/240)。GeneXpert MTB/RIF和M960培養(yǎng)與痰涂片鏡檢陽性率之間的差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=18.49、13.99，P<0.05)，GeneXpert MTB/RIF與M960培養(yǎng)陽性率之間的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.33，P>0.05)。以M960培養(yǎng)為金標準，GeneXpert MTB/RIF的靈敏度為84.0% (68/81，95%CI：76.0～91.9)，特異度為87.8(129/147，95%CI：82.5～93.1)，陽性預(yù)測值(PPV)為78.2%(68/87，95%CI：69.5～86.8)，陰性預(yù)測值(NPV)為87.2% (129/148，95%CI：81.8～92.6)；涂片鏡檢的靈敏度為51.9%(42/81，95%CI：41.0～62.7)，特異度為98.6(145/147，95%CI：96.8～100.0)，PPV為93.3%(42/45，95%CI：86.0～100.0)，NPV為75.1% (145/193，95%CI：69.0～81.2)。GeneXpert MTB/RIF和涂片鏡檢在靈敏度、特異度、PPV和NPV之間差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=19.15、13.73、4.92、7.68，P<0.05)。

2.33種方法陽性檢出時間比較 GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)陽性結(jié)果報告時間(從標本處理到陽性結(jié)果報出)為2.5 h；痰涂片顯微鏡檢查報陽時間平均為3.5 h(包括涂片、干燥、染色及鏡檢時間)；M960培養(yǎng)系統(tǒng)陽性報告時間平均為12 d，培養(yǎng)42 d無結(jié)核分枝桿菌生長報告培養(yǎng)陰性。

2.4藥敏試驗結(jié)果比較 GeneXpert MTB/RIF檢出7例利福平耐藥，耐藥率2.9%(7/240)，M960系統(tǒng)比例法藥敏試驗檢出4例利福平耐藥，6例異煙肼耐藥，8例鏈霉素耐藥，8例乙胺丁醇耐藥，利福平耐藥率1.7%(4/240)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.84,P>0.05)。GeneXpert MTB/RIF檢測出7例利福平耐藥，其中4例M960系統(tǒng)藥敏試驗顯示為利福平耐藥，并且是耐多藥，2例M960系統(tǒng)培養(yǎng)陰性，1例M960系統(tǒng)藥敏試驗顯示為利福平敏感。

2.5GeneXpert MTB/RIF和M960系統(tǒng)一致性分析 兩種方法檢測結(jié)核分枝桿菌的一致性為82.8%，Kappa值為0.73(95%CI：0.61～0.86)。

2.6GeneXpert MTB/RIF和M960系統(tǒng)不一致分析 所有標本中有19份標本GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測陽性，但M960系統(tǒng)培養(yǎng)陰性，通過查閱患者病歷，這19例患者中有15例被醫(yī)生診斷為肺結(jié)核，并進行了相應(yīng)的治療，治療后病情好轉(zhuǎn)。有4例被診斷為肺結(jié)核陳舊灶或穩(wěn)定灶，未進行抗結(jié)核治療。

3 討 論

GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)是一種自動、快速的分子診斷設(shè)備，集標本處理和半巢式PCR于一體的結(jié)核分枝桿菌鑒定和利福平耐藥檢測設(shè)備，其操作簡單、方便[8]。在HIV高流行或結(jié)核病高耐藥地區(qū)此技術(shù)已經(jīng)作為疑似肺結(jié)核的一線檢測方法。

GeneXpert MTB/RIF試驗以半巢式PCR為基礎(chǔ)，此技術(shù)將PCR的樣品準備、DNA擴增和DNA檢測3個步驟整合在一起。樣品處理后加入到測試盒中，在微流樣品盒里完成DNA提取的所有復(fù)雜步驟，并可將提取的DNA進行濃縮和純化，以增加測試的靈敏度。濃縮純化后的標本DNA進入微反應(yīng)管中，并在其中擴增至被檢測到。DNA提取、檢測的整個過程均在儀器配套的密閉的測試盒內(nèi)完成，完全實現(xiàn)自動化，避免人為因素的污染。其對DNA序列的檢測具有高度光學敏感性，實時的熒光監(jiān)測使得軟件一經(jīng)發(fā)現(xiàn)目標序列即可及時給出結(jié)果，極大縮短了檢測時間，檢測全過程僅2 h。

本研究對 GeneXpert MTB/RIF在臨床痰標本中檢測結(jié)核分枝桿菌的檢測效能進行了初步評估。以前的研究顯示，以M960培養(yǎng)為標準，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度為86.2%～97.1%，特異度為95.3%～99.4%[9-11]。在本研究中，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率為36.6%，明顯高于涂片檢查(18.49%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，略高于M960液體培養(yǎng)系統(tǒng)陽性率(34.0%)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其靈敏度和特異度分別為84.0%和87.8%，與以往的研究結(jié)果相似。

涂片鏡檢的陽性率明顯低于GeneXpert MTB/RIF方法和培養(yǎng)，主要是因為其方法的局限性，每毫升標本中需要1 104～5 103個菌才能檢出[12]，GeneXpert MTB/RIF方法每毫升痰標本需要131個標本就能檢出[7]，而將痰標本離心濃縮后培養(yǎng)其陽性檢出限可達到10～100 CFU/mL[12]。

本研究中，與M960培養(yǎng)系統(tǒng)比較，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)顯示出了較好的陽性檢出率，與M960系統(tǒng)具有較好的一致性，并且陽性檢出時間明顯短于培養(yǎng)方法，這對早期發(fā)現(xiàn)患者，快速診斷、及時治療患者非常重要。

本研究中有19份標本GeneXpert MTB/RIF檢測陽性，但M960培養(yǎng)陰性，13份標本GeneXpert MTB/RIF檢測陰性，但M960培養(yǎng)陽性。這可能主要是因為標本中的菌量在檢測方法檢出限水平附近時，在檢測過程中受到外界的影響較大，如標本采集、標本的處理等都可能影響到檢測結(jié)果的準確性。另外，GeneXpert方法是檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，包括活菌和死菌的DNA。而M960培養(yǎng)只能檢測到活菌，因此，在標本處理過程中被殺滅掉的結(jié)核分枝桿菌不能被M960系統(tǒng)檢測到，而GeneXpert系統(tǒng)可能檢測出。一些標本被M960系統(tǒng)檢測出結(jié)核分枝桿菌，而GeneXpert系統(tǒng)未檢測出，可能是由于標本中菌量未達到GeneXpert系統(tǒng)的檢出限。

結(jié)核分枝桿菌中的rpo B基因是利福平耐藥基因，95%以上對利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌有rpo B基因的變異。GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥性是以rpo B基因為靶基因。儀器自動提取結(jié)核分枝桿菌DNA后，對rpo B基因的192 bp片段進行檢測，并采用6種分子信標同時檢測6種探針，其中5個相互重疊分子探針(分別以探針A-E命名)選擇性覆蓋rpo 基因的81 bp核心區(qū)，檢測結(jié)核分枝桿菌存在的同時可以探知利福平是否耐藥。 本研究顯示，7例對利福平耐藥，其中4例M960顯示利福平耐藥，2例M960培養(yǎng)陰性，1例顯示敏感。有文獻報道，以常規(guī)藥敏試驗為檢測利福平耐藥的金標準，GeneXpert MTB/RIF技術(shù)對利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為94.1%和97.0%[13-14]。另外，有大約86%的利福平耐藥菌株同時對異煙肼耐藥，因此，在利福平耐藥的情況下，一定程度下可作為耐多藥結(jié)核分枝桿菌的監(jiān)測指標[15]。 由于本研究中耐利福平病例數(shù)較少，因此其藥敏結(jié)果與M960藥敏結(jié)果的比較還需進一步研究。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)技術(shù)操作簡便，陽性檢出率和敏感性均較高，并且不需較高的專業(yè)技能，普通技術(shù)人員經(jīng)過基本的培訓即可操作。因此，該方法在我國基層實驗室對結(jié)核病診斷及利福平耐藥患者的篩查有一定的應(yīng)用前景。

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