高雅芬 馬 駿

近來有研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)在心肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion，I/R)中起到有害作用。其一旦被激活，配體信號可以通過分別導(dǎo)致NF-κB和IRF-3/7活化的MyD88依賴和MyD88非依賴途徑發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且隨后刺激前炎癥和免疫調(diào)節(jié)細胞因子基因表達。細胞因子釋放有助于中性粒細胞激活、募集、粘附和滲透到心臟損傷部位，進一步延續(xù)炎癥過程和細胞凋亡。本文針對TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及其在心肌缺血再灌注損傷及心肌保護中的作用研究進展綜述如下。

1.TLR4的基本結(jié)構(gòu)與配體

(1)TLR4的基本結(jié)構(gòu) 1985年TLRs(Toll-like receptors，TLRs)因其在果蠅胚胎發(fā)育作用的研究首次被發(fā)現(xiàn)，后來被證實其在固有免疫中發(fā)揮著重要作用。目前已知，在人類細胞中存在10種TLRs，其中6種位于細胞表面并可被多種外源、內(nèi)源性配體激活(TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR6和TLR10)，4種在細胞內(nèi)表達(TLR3，TLR7，TLR8和TLR9)，通常被核酸結(jié)構(gòu)識別[1]。TLR在各種類型的細胞中表達，包括心肌細胞、平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞。人類TLR4是第一個被表征的哺乳動物Toll蛋白，人類心臟中TLR信使RNA的相對表達水平從TLR4、TLR2、TLR3、TLR5、TLR1、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10依次遞減。TLRs是I型跨膜蛋白，由胞膜外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三部分組成，包括作為配體識別結(jié)構(gòu)域的胞外C末端、中心跨膜結(jié)構(gòu)域和類似于IL-1受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。TLRs的胞外域由20-30個氨基酸組成，富含亮氨酸(L)，包括共有序列LxxLxLxxN。TLR4通常形成同二聚體來識別配體，隨后通過促進其下游銜接子的募集來啟動信號傳導(dǎo)。

(2)TLR4配體 TLR4識別的配體分為外源性配體和內(nèi)源性配體兩大類。外源性配體主要為病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，如脂多糖，磷壁酸，肽聚糖，甘露糖和葡聚糖等，較常發(fā)生在機體對外界感染因素所產(chǎn)生的固有免疫過程中。在心肌I/R中，壞死心肌細胞產(chǎn)生的“危險信號”也可以激活免疫應(yīng)答。因此，稱為損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，作為內(nèi)源性配體被TLR識別。近年來研究已證實，心肌I/R過程中可產(chǎn)生多種DAMPs激活TLR4，例如壞死心肌產(chǎn)生的熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)和高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)，I/R導(dǎo)致的細胞外基質(zhì)成分發(fā)生改變，如纖維蛋白原、硫酸乙酰肝素、S100蛋白等[2]。此外，也有研究認為I/R中產(chǎn)生的活性氧及受體-質(zhì)膜的物理改變同樣能產(chǎn)生內(nèi)源性DMAPs激活TLR4[3]。

TLR4識別配體的機制之一依賴于不同TLRs不同的胞外域殘基。位于TLR胞外區(qū)氨基酸序列變異導(dǎo)致結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化，以識別不同的配體。此外，輔因子還可以反映TLR配體組成的多樣性。TLR4形成同源二聚體結(jié)合輔因子，例如CD14，髓樣分化蛋白2和脂多糖結(jié)合蛋白，進一步遞送特定的分子，同時避免其他配體，確保DAMPs的正確檢測。TLR4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行加工折疊時，輔因子也產(chǎn)生了重要的作用，確保TLR4可以到達指定的亞細胞區(qū)室，與配體結(jié)合并啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.TLR4信號傳導(dǎo)通路

(1)MyD88依賴通路 MyD88依賴通路是在TLR4激活后通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)啟動的。MyD88是含Toll /IL-1受體(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，其羧基端連接活化后TLR4的胞內(nèi)TIR樣區(qū)，氨基端結(jié)合IL-1受體相關(guān)激酶4(IL-1 receptor associated kinase 4，IRAK4)，并激活其他IRAK家庭成員之一，IRAK1或IRAK2[4]。通過與磷酸化的IRAK1締合募集TNF受體相關(guān)因子-6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)并將其磷酸化。此后，磷酸化的TRAF6從受體解離并與轉(zhuǎn)化生長因子β激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)，TAK1結(jié)合蛋白-1(TAK1-binding protein 1，TAB1)和TAB2形成復(fù)合物。該復(fù)合物結(jié)合泛素連接酶從而激活I(lǐng)KKα/IKKβ/IKKγ，并誘導(dǎo)IκB磷酸化。磷酸化IκB從復(fù)合物解離，并直接泛素化和蛋白酶體降解，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活釋放。除了激活I(lǐng)KK復(fù)合物，TAK1還可以激活促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路，如ERK通路，JNK通路和p38通路。MAPK信號通路可以激活轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)。NF-κB和AP-1的活化有助于促炎細胞因子如IL-6，IL-1和TNF-α的表達。

(2)MyD88非依賴途徑 TLR4還可以通過MyD88非依賴途徑進行信號傳導(dǎo)，亦稱TRIF依賴途徑。由含TIR樣結(jié)構(gòu)的接頭蛋白TRIF(TIR domain-containing adapter-inducing interferon，TRIF)和TRIF相關(guān)適配子(TRIF-related adapter molecule，TRAM)啟動，可以導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory，IRF)和NF-κB兩者的激活和隨后的干擾素(interferon，IFN)和促炎細胞因子表達。

TRAM和TRIF啟動后，可與TRAF相關(guān)NF-κB激酶1(TBK1)和IKK-ε相互作用，使IRF3磷酸化。TRIF還可以與IRAK1和IKK-ε相互作用，用于激活I(lǐng)RF7。活化的IRF3/7轉(zhuǎn)移到細胞核中，與DNA結(jié)合，并產(chǎn)生如IFN-β的抗病毒分子。在MyD88非依賴途徑中，TRIF也能激活NF-κB。類似于MyD88依賴途徑，TRIF可募集TRAF6和TAK1，通過泛素依賴機制激活NF-κB和MAPK。此外，TRIF也能直接通過募集受體相關(guān)作用蛋白1(receptor interacting protein 1，RIP1)激活NF-κB。因此，TRIF既能通過與TBK1和IRAK1相互作用激活I(lǐng)RF，也能通過招募TRAF和與RIP1相互作用激活NF-κB，RIP1能與fas相關(guān)死亡蛋白相互作用，觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡。

3.TLR4與心肌缺血再灌注損傷

近來有研究發(fā)現(xiàn)，TLR除了在防御病原體入侵的宿主免疫中發(fā)揮著重要作用，其固有免疫的激活也參與I/R的急性炎癥反應(yīng)。當從受損心肌細胞釋放的“危險”信號(DAMPs)與模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)相互作用時，啟動免疫應(yīng)答。Frantz等首次在梗死心肌的重構(gòu)組織中發(fā)現(xiàn)了TLR4表達的增強[5]。Vilahur G等在豬的閉合性冠狀動脈閉塞模型實驗中發(fā)現(xiàn)了與TLR4-MyD88-NF-κB通路和TRIF依賴通路相關(guān)的促炎癥因子和抗病毒分子水平均升高[6]。

(1)TLR4信號通路與心肌再灌注損傷中的有害作用 Oyama 等首次報告了TLR4在小鼠心肌I / R損傷中的有害作用。與野生型小鼠相比，TLR4缺陷型小鼠可減少心臟炎癥反應(yīng)和縮小心肌梗死面積[7]。近年來，Louwe等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性TLR4抑制劑RP105的缺乏可導(dǎo)致炎性狀態(tài)增強，并且在誘導(dǎo)心肌梗死后心臟擴張更顯著，強調(diào)了TLR4信號途徑在心肌梗死后對心肌重構(gòu)的作用[8]。而RP105的過度表達可導(dǎo)致TLR4，P38-MAPK和AP-1信號傳導(dǎo)途徑的失活，抑制隨后產(chǎn)生的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，從而減輕心肌I/R[9]。也有研究表明，心肌缺血損傷后，硫酸乙酰肝素可以通過TLR4/NF-κB，PI3K / AKT途徑增加細胞間粘附分子1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子(VCAM-1)的表達，這有利于脾臟單核細胞和骨髓粒細胞與心臟成纖維細胞粘附，觸發(fā)心肌成纖維細胞分化為心肌纖維細胞形成瘢痕[10]。然而，對于I/R后心臟功能的恢復(fù)，研究結(jié)果不一致，Kim等表明TLR4缺陷小鼠在I/R后，其血清細胞因子水平降低和心肌梗死面積減小，但是心臟功能并未恢復(fù)[11]，F(xiàn)allach等的實驗結(jié)果則相反[12]。

心肌I/R引起強烈的炎癥反應(yīng)，涉及多形核嗜中性粒細胞的滲透、活性氧的生成以及活化補體的形成[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟I/R模型中，在再灌注過程中輸注中性粒細胞，心肌細胞TLR4缺陷的心臟中性粒細胞浸潤更少，然而，輸注TLR4缺陷型中性粒細胞，不影響心臟中性粒細胞的浸潤[14]，提示心肌細胞TLR4是中性粒細胞浸潤所需要的。另外一項研究發(fā)現(xiàn)，白細胞TLR4也參與心肌細胞損傷，丹參多酚酸鹽可能通過抑制單核細胞Toll受體4的環(huán)節(jié)來降低單核細胞黏附分子的表達和黏附能力，進而減輕心肌損傷[15]。Hally KE等人還發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗塞的患者中血小板TLR4數(shù)量顯著上調(diào)[16]。不同細胞TLR4的分布和激活在I/R中心肌損傷的作用尚需進一步探討。ROS生成除了由中性粒細胞激活釋放外，還可能通過激活TLR4上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)和環(huán)氧化酶的表達，增加ROS的產(chǎn)生。缺血再灌注后期TLRs水平及炎癥因子表達水平再次升高，可能損傷心肌結(jié)構(gòu)和功能，其分子機制可能與凋亡(Bcl2、Bax、p53、活性caspase-3)， TLR4-MyD88依賴途徑、TRIF途徑，Akt-mTOR-P70S6K軸激活和纖維化(TGF-β，膠原蛋白A1 / A3)相關(guān)。此外，有研究表明巨噬細胞清道夫受體A類(SR-A)是TLR4的輔助受體，以促進炎癥反應(yīng)，抑制細胞存活和促進細胞凋亡[17]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，與心肌I / R損傷后的野生型小鼠相比，TLR4缺陷小鼠的心肌中活化Akt的水平顯著增加，表明TLR4-MyD88-NF-κB通路和PI3K-Akt信號通路之間存在相互調(diào)節(jié)[18]。推測PI3K-Akt信號通路的激活可能是TLR4缺陷小鼠心肌保護機制的反應(yīng)，PI3K-Akt信號通路可最終作用于線粒體和K+通道，減少mPTP開放和增加K+通道開放來實現(xiàn)心肌保護作用。

(2)TLR4信號通路與心肌再灌注損傷中的心肌保護 許多研究已經(jīng)提出，抑制TLR4信號通路可以減弱炎癥反應(yīng)和心肌I/R導(dǎo)致的細胞凋亡[19-22]。另一種新型TLR4拮抗劑異丁司特(Ibudilast)被發(fā)現(xiàn)可以抑制促炎細胞因子，如TNF和IL-6的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生[23]。但也有研究表明，I/R后應(yīng)用祖細胞治療時，其遷移可能依賴于TLR信號傳導(dǎo)，TLR4信號傳導(dǎo)的治療性阻斷可能會干擾心肌細胞的再生[24]。TLR4或其下游基因的一些配體如脂多糖(LPS)、磷酸葡聚糖(GP)、HMGB1等可以用作預(yù)處理誘導(dǎo)劑，增強對心肌I / R損傷的心肌保護。LPS預(yù)處理的心肌保護作用在TLR4(-/-)或MyD88(-/-)心肌細胞中并不能體現(xiàn)。此外，使用NOS2抑制劑后消除了LPS處理增強心肌細胞存活和功能恢復(fù)的作用。說明MyD88，TLR4，NOS2參與了LPS配體介導(dǎo)的心肌保護[25]。在大鼠I/R模型中，發(fā)現(xiàn)用GP預(yù)處理可減少大鼠心肌再灌注后的梗死面積，其機制涉及減少TLR4與MyD88的結(jié)合，抑制I / R誘導(dǎo)的IRAK和IKKβ活性以及降低NF-κB活性。此外，GP增加TLR4酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致心肌中PI3K-Akt活性增加，這與I/R后心肌細胞凋亡減少相關(guān)。同樣，亞劑量的HMGB1可以誘導(dǎo)心肌I/R保護，而當PI3K-Akt藥物拮抗劑LY294002與HMGB1聯(lián)合給藥時，預(yù)處理效果被廢除[26]。這些數(shù)據(jù)強烈表明在心肌I/ R損傷期間TLR4-MyD88-NF-κB通路和PI3K-Akt信號通路之間存在相互調(diào)節(jié)。值得注意的是，LPS預(yù)處理誘導(dǎo)心肌保護時，至少需要在心肌缺血前8h接受預(yù)處理，而GP預(yù)處理在心肌缺血前1h和缺血發(fā)生后5分鐘內(nèi)就可以通過相關(guān)機制產(chǎn)生心肌保護。這表明GP的心肌保護機制與LPS不同。這些實驗也表明TLR4及其下游基因可能是潛在的治療靶點，用這些分子預(yù)處理可以降低與心肌I/R相關(guān)的發(fā)病率和病死率。

HSP60作為TLR4內(nèi)源性DAMPs的一種，激活TLR時與LPS、GP預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護的作用卻恰恰相反。在小鼠心肌I/R模型中，內(nèi)源性產(chǎn)生的HSP60通過TLR4-MyD88-p38/NF-κB通路誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生，并通過TLR4-MyD88-JNK/NF-κB通路上調(diào)TLR4的表達，最終引起心肌炎癥[27]。同樣，外源性的重組HSP60通過心肌細胞中的TLR4誘導(dǎo)凋亡。TLR4信號由LPS或易位HSP60激活導(dǎo)致細胞分別存活和凋亡的機制尚不清楚，可能與TLR4識別配體時參與的特異輔因子的不同有關(guān)。由此可見，TLR4在應(yīng)答非感染性損傷時，在介導(dǎo)組織炎癥和細胞存活中發(fā)揮著廣泛的作用。

4.總結(jié) 大量證據(jù)表明，TLR4通過MyD88依賴途徑增強許多促炎基因表達，從而加重心肌損傷。抑制TLR4信號通路是心肌炎癥的緩解方法，然而對心臟功能恢復(fù)的保護作用仍然有質(zhì)疑。直接抑制TLR4可能導(dǎo)致其固有的免疫機制功能喪失，TLR4在心肌內(nèi)同時參與宿主免疫和組織修復(fù)過程， TLR4可以激活MyD88非依賴途徑，并進一步促進IFN-β表達，對心肌炎癥產(chǎn)生有益作用。

此外，靶向TLR4信號通路的預(yù)處理可以有效地減輕心肌I/R。一些其他信號傳導(dǎo)途徑可以與TLR4信號傳導(dǎo)途徑相互調(diào)節(jié)，并對心肌炎癥發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。例如PI3K-Akt信號通路參與心肌I/R過程中的心肌保護，并且減少TLR4缺陷小鼠不良的心肌重塑。在調(diào)節(jié)TLR4信號傳導(dǎo)期間是否可減少心肌炎癥的同時保證免疫的優(yōu)勢是需要進一步研究的重要問題。