彭細(xì)峰　鄧江濤　葉靜梅　姜文浩

[摘要]目的觀察羥基喜樹堿對體外培養(yǎng)的球后成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法甲狀腺相關(guān)眼病患者球后成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)。免疫組織化學(xué)染色檢測波形蛋白在球后成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。將不同濃度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L組）作用于球后成纖維細(xì)胞48h，用MTT法檢測各組藥物對細(xì)胞增生的抑制率。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白、采用Western blotting法檢測活化型caspase-3和caspase-3、bax和bcl-2、p-JNK和JNK、p-AKT和Akt在HCPT中的表達(dá)。結(jié)果MTF法顯示不同濃度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L組）能降低成纖維細(xì)胞細(xì)胞的A值（P<0.05），細(xì)胞生長抑制率隨藥物濃度的增加而增加。流式細(xì)胞儀檢測凋亡率隨著濃度的增加而增高；Western blotting法檢測結(jié)果證明，活化型caspase-3、bax、p-JNK表達(dá)的灰度值明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論羥基喜樹堿能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)球后成纖維細(xì)胞，其作用呈劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞]羥基喜樹堿；甲狀腺相關(guān)眼??；球后成纖維細(xì)胞；凋亡

[中圖分類號]R771.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-26-04

甲狀腺相關(guān)眼?。╰hyroid associated ophthalmopathy，TAO）發(fā)病率居眼眶疾病之首。它的發(fā)病機制目前還不完全清晰，研究表明TAO是一種自身免疫或器官免疫性疾病。球后成纖維細(xì)胞（retroocularfibroblasts，RF）在TAO發(fā)病中起至關(guān)重要作用。因此，怎樣抑制球后成纖維細(xì)胞的增生，找到最佳的治療方法是目前臨床上急需要解決的問題。有實驗證實，羥基喜樹堿（hvdroxycamptothecin，HcPT）可以對抗腫瘤，而且可以對抗纖維化。本實驗研究羥基喜樹堿對體外培養(yǎng)的TAO患者球后成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并從細(xì)胞傳導(dǎo)通路的途徑探討羥基喜樹堿對球后成纖維細(xì)胞可能作用機制。

1材料與方法

1.1一般材料

眼眶脂肪組織5例來自于2016在深圳市龍崗中心醫(yī)院行眼眶減壓手術(shù)的TAO患者，他們均為靜止期患者，其中男3例，女2例。5例手術(shù)患者都符合TAO的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且排除了其他自身免疫性疾病和腫瘤相關(guān)性疾病等。5例患者術(shù)前均已經(jīng)簽署知情同意書。手術(shù)時期的甲狀腺功能正常達(dá)半年。羥基喜樹堿（純度≥99%，成都蘭貝植化有限公司，批號100903）；鼠抗人波形蛋白抗體、羊抗鼠Cy3熒光抗體（sc-166894，Sigma，美國）；CCK-8試劑盒（Promega，美國）；兔抗人caspase-3抗體，ab71481），兔抗人活化型caspase-3抗體，ab32042）、兔抗人bax抗體（ab32503）、兔抗人bcl-2抗體（ab2123）、鼠抗人B-actin抗體（ab6276）（Abcam，英國）、兔抗人JNK抗體（9258）、兔抗人p-JNK抗體（4668）（CST，美國）、羊抗鼠二抗（sc2058）、羊抗兔二抗（sc2007）（Santa，美國）、ECL顯影液（Millipore，美國）、臺式離心機、流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur，美國）。

1.2方法

1.2.1球后纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 手術(shù)中取出的眼眶組織放入培養(yǎng)瓶。用組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，選其中的第2代到第6代細(xì)胞進(jìn)行實驗。免疫組織化學(xué)染色鑒定：對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長至半滿后，將玻片取出，免疫組化染色制片。一抗用兔抗人波形蛋白單克隆抗體，二抗用生物素化羊抗兔IgG。

1.2.2對細(xì)胞生長影響的檢測 （1）空白對照組：加單細(xì)胞懸液和與藥物處理組相同體積DMSO溶劑，不加其他藥物，使DMSO在培養(yǎng)液中的濃度保持在≤1%；（2）藥物處理組：細(xì)胞懸液中加入5種不同質(zhì)量濃度的HCPT，使它的終濃度為1、5、10、50、100mg/L。將1×10⁴個/mL的成纖維細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL體積，第1孔加和藥物處理組等同體積的培養(yǎng)液，不加細(xì)胞及任何藥物，設(shè)定為空白空白對照組孔。空白對照組設(shè)置4個重復(fù)孔，各藥物處理組設(shè)置4個重復(fù)孔。培養(yǎng)48h后每孔加入MTT溶液，37℃培養(yǎng)4h后去除上清液，每孔分別加入150μL DMSO，震蕩10min后等待結(jié)晶溶解?？瞻卓自O(shè)為零，用酶聯(lián)免疫檢測儀測490nm波長的光吸收值。計算各組的細(xì)胞生長抑制率，求平均值。細(xì)胞生長抑制率（%）=（空白對照組A490-藥物處理組A490）/空白對照組A490×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 將4×10⁴/mL細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，每瓶5mL（2×10⁵細(xì)胞），總共18瓶（每濃度3瓶）。空白對照組為RPM11640培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，藥物處理組加入不同質(zhì)量濃度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L），培養(yǎng)48h，收集于離心管，1000rpm離心5min后，PBS洗滌2次，70%的乙醇進(jìn)行固定，4℃以下過夜。PI染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4Western blot法檢測 caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、p-JNK、JNK、p-AKT和Akt在HPCT中的表達(dá) 取空白對照組、1、5、10、50、100mg/L HCPT組處理48h的細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗3遍。加入含有100mmol/L PMSF裂解液400μL，冰上裂解30min。離心半徑4cm，4℃ 12000dmin離心5min后，去除上清液后用BCA法進(jìn)行測定，調(diào)至等質(zhì)量濃度。按順序行質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶予以封閉2h，4℃封閉，一抗過夜，TBST進(jìn)行清洗3次后曝光顯影，采用計算機軟件分析灰度值并記錄，以目的蛋白/β-actin進(jìn)行灰度值校正，計算各組灰度值比例，再計算出活化型caspase-3/caspase-3、bax/bcl-2、p-JNK/JNK、p-AKT/Akt的比例，以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。計量資料以（x±s）表示，各組數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析，各藥物處理組與空白對照組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1球后成纖維細(xì)胞免疫組化鑒定

SP法染色體外培養(yǎng)的球后成纖維細(xì)胞見波形蛋白表達(dá)陽性，位于胞漿，與成纖維細(xì)胞長軸方向一致的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和棕黃色束狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞角蛋白表達(dá)陰性。

2.2MTT檢測HCPT對RF增殖的作用

不同濃度HCPT干預(yù)成纖維細(xì)胞48h后，MTT法檢測細(xì)胞的吸光值（A值）及計算出的平均細(xì)胞生長抑制率分別見表1。藥物處理組與對照組細(xì)胞A值的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3不同濃度HCPT作用后RF的凋亡情況

空白對照組細(xì)胞的凋亡率（0A3±0.16）%，各藥物濃度作用下成纖維細(xì)胞凋亡率均比空白對照組凋亡率高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4活化型caspase-3/caspase-3、bax/bd-2、p-JNK/JNK、p-AKT/AKT在不同藥物處理組RF中的表達(dá)變化

Western blot法檢測結(jié)果表明，活化型caspase-3、bax、p-JNK在空白對照組RF中僅有少量表達(dá)，在HCPT處理組中的表達(dá)明顯多于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Bcl-2、p-AKT在空白對照組RF中的表達(dá)量最高，在HCPT處理組中的表達(dá)隨著濃度的增加表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同濃度HCPT干預(yù)球后成纖維細(xì)胞48h后，采用重復(fù)測量方差分析，細(xì)胞的活化型caspase-3/caspase-3、bax/bcl-2、p-JNK/JNK、p-AKT/Akt的比例值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表3。

3討論

甲狀腺相關(guān)眼病又稱Graves眼病，內(nèi)分泌突眼。國內(nèi)外對甲狀腺相關(guān)眼病的研究呈上升的趨勢。由于發(fā)病機制尚不明晰，各種治療方法的效果都不是特別理想。成纖維細(xì)胞的增殖在多種眼病中擔(dān)任著重要角色，例如增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、青光眼手術(shù)后疤痕組織增生、翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)等。有研究證實，球后成纖維細(xì)胞既是TAO發(fā)展中的靶細(xì)胞，同時也是效應(yīng)細(xì)胞，參與及完成了多個免疫反應(yīng)。臨床圍繞抗纖維化，試驗了5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、環(huán)孢霉素A、全反式維甲酸、秋水仙堿等多種藥物，可這些藥物的毒性作用、副作用都比較大，因此在臨床使用比較局限。羥基喜樹堿是從珙桐科植物喜樹中提取出來的一種生物堿，剛開始用于抗腫瘤，有毒、副作用偏小、水溶性好、患者易耐受等特點，它主要通過抑制細(xì)胞增生、誘導(dǎo)凋亡、影響細(xì)胞周期等機制發(fā)揮作用，在非腫瘤性疾病等方面也發(fā)揮了重要作用。已有研究證實羥基喜樹堿可以抗纖維增生。但對體外培養(yǎng)的TAO患者球后成纖維細(xì)胞的增殖是否有影響還沒有見研究報道。我們采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，觀察HCPT對球后成纖維細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)1、5、10、50、100mg/L HCPT作用于球后成纖維細(xì)胞48h后，能抑制TAO患者球后成纖維細(xì)胞的增殖；而且隨著藥物濃度增加，MTT法所測得的吸光值降低，抑制率增高；提示HCPT是呈劑量依賴性的方式抑制球后成纖維細(xì)胞的增殖。研究的結(jié)果和其他學(xué)者研究的結(jié)果是一致的。因此我們推測當(dāng)較高濃度的HCPT作用于球后成纖維細(xì)胞時，有可能誘導(dǎo)了球后成纖維細(xì)胞的凋亡。

在HCPT處理體外培養(yǎng)的RF通過什么樣的途徑誘導(dǎo)凋亡？本實驗從細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路方面進(jìn)行了研究。正常組織的代謝需要組織增殖和凋亡維持平衡才能進(jìn)行。多種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的基因/蛋白參與了球后成纖維細(xì)胞增殖。與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因有Bcl-2和Bax蛋白，Bcl-2基因是一個長壽基因，Bcl-2基因位于第18號染色體，Bcl-2蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑中起著非常關(guān)鍵的作用，通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子參與的物質(zhì)轉(zhuǎn)運以及膜通透性轉(zhuǎn)換從而阻止細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來，達(dá)到阻止細(xì)胞凋亡的反應(yīng)，它主要通過抵抗細(xì)胞的死亡延長細(xì)胞的壽命，從而引起細(xì)胞的數(shù)目增多，即是抑制細(xì)胞凋亡。Bax基因促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。兩者的比例決定了細(xì)胞的凋亡。Bcl-2先要與Bax結(jié)合成二聚體才可以抑制細(xì)胞的凋亡。Bcl水平降低則不能平衡Bax的作用，引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，反之則導(dǎo)致細(xì)胞的增殖。有實驗證明，HCPT能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機制可能與下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)。本實驗采用流式細(xì)胞檢測儀測到不同質(zhì)量濃度的HPCT處理球后成纖維細(xì)胞48小時后，胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平與空白對照組比較有降低，提示可以降低Bcl-2的表達(dá)水平是HPCT誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡的機制之一。Caspase-3是細(xì)胞凋亡激活中重要的蛋白，它在細(xì)胞凋亡的過程中起著最后執(zhí)行作用。它平常以無活性的前體形式存于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到某些凋亡信號刺激時，caspase-3隨即可裂解為活化型的caspase-3，并且通過酶切特異性底物拆散細(xì)胞骨架，組織DNA的修復(fù)，干擾信使核糖核酸的剪切，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JNK是信號蛋白，其通過磷酸化而激活發(fā)揮生物效應(yīng)。P-JNK可以下調(diào)bcl-2，c-IAPI通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。AKT磷酸化激活可以促進(jìn)細(xì)胞增生，抑制細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果顯示，p-AKT的表達(dá)量隨著HCPT濃度的增加反而降低，提示AKT保護(hù)作用的減弱是本實驗促進(jìn)細(xì)胞凋亡的很重要的因素。

本實驗研究結(jié)果表明，HCPT能抑制球后成纖維細(xì)胞增殖，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性，提示HCPT在治療TAO方面有良好前景，為今后TAO臨床研究提供了新的思路和方向。目前的研究僅局限于離體的實驗，體內(nèi)的試驗效果如何，有待進(jìn)一步研究。

（收稿日期：2017-05-02]