周景明，翟圓君，耿 玥，祁艷華，劉紅亮，王愛萍

(鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001)

1993年，Hamers-Casterman C等發(fā)現(xiàn)駱駝免疫系統(tǒng)內(nèi)存在一種僅由重鏈單一的折疊單元組成的抗體，將其稱為單域重鏈抗體(variable domain of heavy-chain of heavy-chain antibody,VHH)或納米抗體(nanobody,Nbs)[1]。納米抗體僅由重鏈抗體的可變區(qū)組成，較普通抗體具有一些獨(dú)特性能[2]，如分子量小、穩(wěn)定性高、親和力高[3]、免疫原性弱、良好而廣泛的抗原結(jié)合能力[4]以及水溶性好等特點(diǎn)[5]，使其在病原的檢測、食品安全分析[6]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

本研究采用未經(jīng)免疫的駱駝淋巴細(xì)胞為起始試驗(yàn)材料，擴(kuò)增全套單域抗體基因，構(gòu)建駱駝非免疫噬菌體抗體庫，鑒定抗體庫的庫容量及多樣性。萊克多巴胺(ractopamine，RAC)是“瘦肉精”的一種，在豬等動(dòng)物體內(nèi)殘留的萊克多巴胺，累積超過一定量時(shí)，對動(dòng)物本身產(chǎn)生毒副反應(yīng)，也可通過食物鏈進(jìn)入人體，因此對其檢測具有重要意義[7]。利用萊克多巴胺人工抗原，對駱駝天然單域抗體噬菌體展示文庫進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示文庫多樣性良好，為淘選獲得針對特定抗原的單域重鏈抗體奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笥邢薰井a(chǎn)品；RNA提取試劑Trizol、RT-PCR試劑盒、EX-TaqDNA聚合酶、DNA試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶，New England Biolab公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Tiangen公司產(chǎn)品；Anti Phage M13 MAb(HRP),Solarbio公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株及噬菌粒 大腸埃希菌TG1，鄭州大學(xué)分子免疫實(shí)驗(yàn)室保存；輔助噬菌體M13KO7，購自New England Biolab公司；噬菌粒載體pCANTAB5E，購自Bio Vector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心。

1.1.3 引物 文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物參照文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)(表1)。VHH-SfiⅠ位于可變區(qū)的框架區(qū)1 (framework region 1，F(xiàn)R1)，并在其5′ 端引入了SfiⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，VHH1-NotⅠ和VHH2-NotⅠ分別位于兩種重鏈抗體的鉸鏈區(qū)(hinge region)，在5′端引入了NotⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基(下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列)。

1.2 方法

1.2.1 萊克多巴胺人工抗原的制備與鑒定 采用1，4-丁二醚法(Linker 法)制備RAC-OVA人工抗原，利用混合酸酐法制備 RAC人工抗原RAC-BSA，采用紫外光譜掃描和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定人工抗原是否偶聯(lián)成功。

表1 文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞的分離和總RNA的提取 取駱駝外周血，以109 mmol/L檸檬酸鈉抗凝。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，按每107細(xì)胞溶于1 mL的Trizol試劑中，參照Trizol試劑使用說明抽提總RNA。提取后的總RNA用去離子水溶解，測定濃度，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 駱駝重鏈抗體可變區(qū)的擴(kuò)增 以總RNA為模版，Oligo(dT)18為引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成第一鏈cDNA。參照表1合成PCR引物，以cDNA為模版，PCR擴(kuò)增重鏈抗體的可變區(qū)片段VHH。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃ 35 s， 63℃ 35 s， 72℃ 35 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，經(jīng)DNA片段回收試劑盒回收定量，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 噬菌體單域抗體庫的構(gòu)建 將噬菌粒載體pCANTAB5E和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物VHH分別用NotⅠ和SfiⅠ進(jìn)行酶切反應(yīng)。用DNA回收試劑盒回收酶切片段,與酶切后的pCANTAB5E載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入新鮮制備的感受態(tài)大腸埃希菌TG1，轉(zhuǎn)化后的菌液于LB液體培養(yǎng)基中在37℃、220 r/min培養(yǎng)1 h。將轉(zhuǎn)化菌液濃縮后，涂若干塊平板培養(yǎng)基(含20 g/L葡萄糖和Amp的2×YT培養(yǎng)板)，同時(shí)取10 μL倍比稀釋計(jì)算庫容，37℃培養(yǎng)過夜。次日，計(jì)算菌落形成單位(CFU)，即為噬菌體抗體庫的滴度，并從平板上隨機(jī)挑選20個(gè)單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，以確定抗體庫的重組率。挑取8個(gè)單克隆，送生物技術(shù)服務(wù)公司測序。剩余菌液加入適量的2×YT/Amp液體培養(yǎng)基和M13K07，37℃過夜培養(yǎng)。次日，用200 mL/L的PEG8000/NaCl從菌液上清中分離噬菌體，并懸浮于PBS中。

1.2.5 RAC特異性重組噬菌體的淘選 富集篩選重組噬菌體的方法具體如下：用NaHCO3緩沖液稀釋RAC-BSA，使其終濃度為100 μg/mL，100 μL/孔包被于酶標(biāo)板中，4℃過夜。次日，棄掉板中包被液，用TBST洗滌4次，加入封阻緩沖液，200 μL/孔，37℃封閉2 h。倒掉封閉液，用TBST(TBS+1 mL/L Tween-20)，快速洗滌10次。然后在干凈的紙巾上甩拍，以除去洗滌液，加入噬菌體，100 μL/孔，37℃孵育1 h。棄去未結(jié)合的噬菌體，用TBST洗滌10次，再用TBS洗5次。加入緩沖洗脫液，100 μL/孔，把結(jié)合的噬菌體洗脫到洗脫液中，溫和搖動(dòng)8 min。把洗脫液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，加入100 μL中和緩沖液，使洗脫液為中性。取中和后的洗脫液少許測定滴度，其余用于擴(kuò)增。取400 μL洗脫液，感染4 mL對數(shù)期TG1細(xì)胞，搖勻后37℃靜置30 min，加入16 mL的2×YT/AMP-GLU培養(yǎng)，37℃、220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期。向培養(yǎng)液中加入20 μL的M13KO7輔助噬菌體，搖勻后室溫靜置30 min，2 800 r/min室溫離心10 min，棄上清，菌體用100 μL 2×YT/AMP-KANA培養(yǎng)基重懸，37℃、220 r/min培養(yǎng)14 h。用PEG8000/NaCl溶液對其進(jìn)行濃縮純化，每管加入0.5 mL PBS，重懸噬菌體沉淀。

重復(fù)步驟，完成第2輪和第3輪淘選。RAC-BSA包被原濃度依次降低，分別為100、50、25 μg/mL。洗滌液中的Tween20的含量依次升高，分別為1、3、5 mL/L。

1.2.6 陽性克隆的phage-ELISA鑒定 從第3輪篩選中大平皿上挑取單菌落于96孔板中，分別進(jìn)行擴(kuò)增純化，取每輪篩選后擴(kuò)增的噬菌體庫，用phage-ELISA檢測特異性重組噬菌體，步驟如下：將RAC-OVA用PBS緩沖液稀釋至10 μg/mL,取96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 μL，4℃包被過夜。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，加入封閉液，每孔加入200 μL，室溫封閉2 h。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，取濃縮純化的噬菌體溶液，用封閉液稀釋后加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，室溫孵育2 h。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，加入稀釋好的鼠抗M13噬菌體單抗(以50 g/L的脫脂奶1∶5 000稀釋)，每孔100 μL，室溫孵育2 h。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，加入TMB顯色底物，每孔加入100 μL，室溫避光顯色5 min左右。顯色完成后，每孔加入100 μL 3 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定各孔OD 450 nm值。

1.2.7 重組納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)及粗提物的獲取 取篩選得到的陽性噬菌體擴(kuò)增純化后，加入含有1 mmol/L IPTG，37℃、200 r/min誘導(dǎo)過夜。取培養(yǎng)液，3 200 r/min 4℃離心10 min，棄上清，放入-20℃冰箱，冷凍30 min。取出，室溫放置15 min，每孔加入500 μL PBS，250 r/min振蕩30 min重懸菌體。3 500 r/min 4℃離心15 min，收集上清即為可溶性重組納米抗體粗提物，用于下一步ELISA檢測。

1.2.8 可溶性重組納米抗體的 ELISA檢測 ELISA檢測可溶性重組納米抗體粗提物的步驟如下：將RAC-OVA用PBS緩沖液稀釋至4 μg/mL,取96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 μL，4℃包被過夜，PBS作為無抗原對照。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，每孔加入200 μL封閉液，室溫封閉2 h。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，取可溶性重組納米抗體粗提物，用封閉液稀釋后加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，室溫孵育2 h。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，加入稀釋好的兔抗E-tag 多克隆抗體(以50 g/L的脫脂奶1∶2 000稀釋)，每孔100 μL，室溫孵育2 h。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，加入稀釋好的二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG)。用PBST洗滌酶標(biāo)板4次，加入TMB顯色底物，每孔加入100 μL，室溫避光顯色5 min左右。顯色完成后，每孔加入100 μL 3 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定各孔OD 450 nm值。

2 結(jié)果

2.1 萊克多巴胺人工抗原的鑒定

2.1.1 紫外光譜掃描鑒定結(jié)果 載體蛋白OVA和BSA在279 nm處有最大吸收峰，RAC在274 nm處有最大吸收峰(圖1)。合成的人工抗原的最大吸收峰與OVA和BSA的最大吸收峰相比，發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象，與相關(guān)報(bào)道一致，說明RAC與載體蛋白偶聯(lián)成功(圖2)。

圖1 RAC-OVA、OVA、RAC紫外掃描結(jié)果

圖2 RAC-BSA、BSA、 RAC紫外掃描結(jié)果

2.1.2 紫外光譜掃描鑒定結(jié)果 BSA分子質(zhì)量約為67 ku，OVA分子質(zhì)量約為43 ku，偶聯(lián)物RAC-OVA、RAC-BSA分子質(zhì)量有所增加，其條帶比OVA、BSA條帶滯后，與相關(guān)報(bào)道基本一致，證明偶聯(lián)成功(圖3)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.RAC-OVA；2.OVA；3.RAC-BSA；4.BSA

M.Protein molecular weight Marker；1.RAC-OVA；2.OVA；3.RAC-BSA；4.BSA

圖3 RAC-OVA、RAC-BSA的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.3 SDS-PAGE results of RAC-OVA and RAC-BSA

2.2 總RNA的提取及分析

經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，從駱駝外周血收集到約109個(gè)淋巴細(xì)胞。紫外分光光度法測定提取總RNA， OD 260 nm/OD 280 nm=1.95，濃度為1 658 ng/μL，表明提取的總RNA分子完整，無降解(圖4)。

2.3 駱駝重鏈抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增

以從駱駝外周血淋巴細(xì)胞提取的總RNA為模板，用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用引物VHH-SfiⅠ和VHH1-NotⅠ、VHH2-NotⅠ分別進(jìn)行駱駝重鏈可變區(qū)長片段和短片段基因的擴(kuò)增。結(jié)果顯示，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，獲得的片段大小約為500 bp的駱駝重鏈可變區(qū)基因VHH，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化回收后用于后續(xù)試驗(yàn)(圖5)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1、2.總RNA

M.DNA Marker DL 2 000;1,2.Total RNA

圖4總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of total RNA

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;S.短鉸鏈段；L.長鉸鏈片段

M.DNA Marker DL 2 000;S.Short segments of hinge;L.Long segments of hinge

圖5 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.5 Agarose gel electrophoresis results of PCR products

2.4 噬菌體重鏈單域抗體庫的構(gòu)建及鑒定

將等量的長片段和短片段重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行雙酶切，用同樣的酶對噬菌質(zhì)粒載體pCANTAB5E進(jìn)行雙酶切，雙酶切的結(jié)果如圖6所示。分別以1∶1、3∶1和5∶1的PCR產(chǎn)物-載體摩爾比進(jìn)行連接，取10 μL連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸埃希菌TG1，加入1 mL的LB培養(yǎng)基孵育后，吸取100 μL涂布LB/Amp平板，培養(yǎng)過夜。當(dāng)摩爾比為3∶1時(shí)，得到的菌落數(shù)最多，以此比率進(jìn)行大規(guī)模連接。多次電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞TG1后，獲得抗體文庫。

隨機(jī)挑取文庫中的20個(gè)單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示有18個(gè)陽性克隆，說明天然抗體庫重組率大約為90%，菌落計(jì)數(shù)計(jì)算得文庫的庫容量約為107CFU/mL(圖7)。挑取了8個(gè)克隆送至金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測定，將測序結(jié)果翻譯為氨基酸序列，經(jīng)過多序列比對分析，結(jié)果顯示，8個(gè)克隆的外源片段均為編碼重鏈抗體可變區(qū)的基因(圖8)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;1.VHH;2.噬菌粒載體

M.DNA Marker DL 15 000;1.VHH;2:Phagemid vector

圖6 VHH及噬菌體載體雙酶切鑒定

Fig.6 Identification of phagemid vector and VHH bySfiⅠ andNotⅠ digestion

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;1～20.隨機(jī)挑取克隆

M.DNA Marker DL 15 000;1-20.Random selected clones

圖7文庫PCR鑒定結(jié)果

Fig.7 PCR identification results of library

圖8 VHH抗體庫中8個(gè)隨機(jī)克隆氨基酸序列

2.5 噬菌體單域抗體庫的篩選富集情況

將RAC-BSA作為包被抗原篩選特異性納米抗體，在篩選過程中，對每一輪洗脫和擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行滴度測量，用來評估特異性VHH重組噬菌體的富集效果。結(jié)果如表2及圖9所示，萊克多巴胺納米抗體的篩選效果主要通過回收率來評價(jià)，本試驗(yàn)對噬菌體抗體庫進(jìn)行了2 輪擴(kuò)增和3 輪淘選的過程，包被的抗原量逐漸減少而洗脫強(qiáng)度逐漸增大，回收率卻逐漸增大，說明篩選過程中特異性吸附的抗體已經(jīng)得到了明顯的富集(回收率(%)=噬菌體洗脫量/噬菌體投入量×100%)。

表2 篩選過程中噬菌體的回收率

2.6 phage-ELISA鑒定陽性克隆

對隨即挑選出的單菌落擴(kuò)增后進(jìn)行phage-ELISA鑒定，試驗(yàn)組包被RAC-OVA，對照組包被OVA，經(jīng)鑒定有3株陽性克隆，分別命名為A4、C5、D9(圖10)。

由圖10可以看出，包被RAC-OVA孔的OD值為包被OVA孔OD值的2倍以上，由此可以說明，篩選出的納米抗體是針對萊克多巴胺的抗體，可進(jìn)行后續(xù)抗體表達(dá)、鑒定試驗(yàn)。其中，單克隆A8進(jìn)行phage-ELISA鑒定表明，單克隆A8不僅可以與RAC-OVA結(jié)合，還能與OVA結(jié)合，篩選出的陽性克隆A8與載體蛋白OVA有較大的交叉反應(yīng)。

圖9 三輪淘選噬菌體回收率

圖10 ELISA方法鑒定特異性陽性克隆

2.7 可溶性重組納米抗體粗提物的ELISA檢測

用ELISA方法檢測納米抗體粗提物的特異性，結(jié)果顯示，PBS作為無抗原對照NC,相對于對照組，納米抗體粗提物具有抗原結(jié)合能力,OD值大于PBS對照3倍以上(圖11)。

圖11 ELISA鑒定納米抗體的結(jié)合能力

3 討論

駱駝血液中有3種類型的IgG，分別為 IgG1、IgG2和 IgG3，其中IgG1為傳統(tǒng)抗體，而IgG2和IgG3屬于單域重鏈抗體。這種納米抗體由于天然缺失輕鏈，具有親和力高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以在原核細(xì)胞中表達(dá)[10-11]，大大降低了制備抗體的成本和周期。由于駱駝或鯊魚等屬于稀有大型動(dòng)物，對其進(jìn)行主動(dòng)免疫而獲得特異性抗體，操作困難，所以通過構(gòu)建天然納米抗體文庫，從中淘選特異性抗體，避免復(fù)雜的免疫過程，操作簡便。納米抗體不但分子量小，而且表位識(shí)別能力強(qiáng)，所以可以識(shí)別微量抗原，例如較難檢測出的靶點(diǎn)[12]以及毒素或外來病原[13]。本試驗(yàn)構(gòu)建非免疫噬菌體抗體庫，操作簡便，耗費(fèi)時(shí)間短。

噬菌體展示技術(shù)具有操作簡單、篩選周期短等優(yōu)點(diǎn)，可以對較大容量的文庫進(jìn)行高通量篩選，是篩選納米抗體常用的方法。構(gòu)建庫容量大、多樣性好的文庫是從中淘選出親和力高、特異性強(qiáng)的納米抗體的關(guān)鍵。本試驗(yàn)獲得了庫容約為107的抗體文庫，序列分析結(jié)果表明文庫具有較好的多樣性，可以用于其他目標(biāo)抗體的篩選。

綜上所述，本試驗(yàn)通過構(gòu)建庫容量大，多樣性好的天然噬菌體抗體庫，為進(jìn)一步篩選其他特異性納米抗體奠定了基礎(chǔ)。

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