王 超，陳 欣，張夢南，黃 晨，李 睿，劉夢志，劉寶山,姚龍泉,陳新亮，尹榮煥

(沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)是一種革蘭陰性菌，屬于巴氏桿菌屬，能夠引起豬的多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎以及關(guān)節(jié)炎綜合征，其導致的疾病被稱為Gl?seer病[1]?，F(xiàn)已確定的Hps血清型有1～15血清型，其中血清型1、5、10、12、13和14株是強毒株，豬感染后4 d內(nèi)可引起死亡；血清型6、7、9和11株是無毒力株；血清型2、3、4、8和15株是中等毒力菌株，只有在特定情況下才可使豬發(fā)生漿膜腔積液或死亡[2-4]。強毒株能夠通過破壞鼻黏膜進入血液，隨著血液流動到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過血腦屏障，最終造成腦膜炎的發(fā)生[5-6]。還證實該菌的大多數(shù)臨床分離株能夠黏附并侵入宿主細胞。Cerda-Cuellar和 Aragon發(fā)現(xiàn)大部分毒力菌株都為血清抗性[7]。總之，強毒株能夠逃避宿主的免疫反應，從而擴散到內(nèi)臟，導致全身性疾病的發(fā)生。

外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)是革蘭陰性菌外膜成分的重要組成部分，高度保守，具有膜結(jié)構(gòu)的完整性。研究表明，OmpA與血清抗性，對細胞的黏附及侵襲都有密切關(guān)系[8-10]。Hps外膜蛋白P5(OmpP5)是由OmpP5基因編碼的，現(xiàn)已確定為OmpA家族成員[11]。Euba B等[12]在研究非典型流感嗜血桿菌時發(fā)現(xiàn)，OmpP5基因與小鼠肺部病變相關(guān)。Zhang B等[13]敲除Hps SC096菌株基因組中的OmpP5基因后發(fā)現(xiàn)菌株生長速度變慢。已證實OmpP5是副豬嗜血桿菌產(chǎn)生毒力的相關(guān)基因[14]。迄今為止，還沒有針對副豬嗜血桿菌遼寧分離株OmpP5基因的分析報道。本研究對從遼寧省某豬場分離到1株Hps，對其外膜蛋白編碼基因OmpP5進行克隆測序，并和已發(fā)表的不同血清型Hps OmpP5基因序列進行對比分析，以期發(fā)現(xiàn)不同Hps OmpP5基因間的差別，為闡明遼寧省副豬嗜血桿菌的毒力相關(guān)性、免疫原性及疫苗開發(fā)等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源及菌種 從遼寧省阜新市某豬場發(fā)生疑似副豬嗜血桿菌病的病死豬中采集典型的病變豬肺作為待檢病料；金黃色葡萄球菌ATCC 29213，沈陽農(nóng)業(yè)大學人獸共患病重點實驗室保存；副豬嗜血桿菌參考菌株，華中農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室贈予的臨床分離株。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)、胰蛋白大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB) 、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和無菌胎牛血清，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品；pEASY-T5 zero Cloning kit、Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞、DNA Marker DL 2 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司產(chǎn)品；特異性引物由上海生工生物工程服務有限公司合成；葡萄糖、木糖、山梨醇等生化管，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設備 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；核酸水平電泳儀和電泳槽，北京六一儀器廠產(chǎn)品；AIRTECH蘇凈安泰潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)公司產(chǎn)品；電子天平，德國Sartorious公司產(chǎn)品；PCR基因擴增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品； LEICA DM750顯微鏡，LEICA公司產(chǎn)品；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)Tanon-1600，上海將來實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢 用已滅菌的手術(shù)刀將病料切開，取內(nèi)層病變組織，放入生理鹽水中，混勻后，吸取100 μL放入TSA平皿中涂布均勻后，放入體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后挑取邊緣圓滑、表面凸起光滑、針尖狀、半透明的菌落繼續(xù)劃線純化直至長出形態(tài)單一菌落，命名為LNFX0225，然后進行革蘭染色及鏡檢。

1.2.2 生化試驗 挑取上述單個菌落接種于TSB試管中，37℃培養(yǎng)18 h。用接種針蘸取試管中菌液分別接種于麥芽糖、氧化酶、吲哚等微量生化鑒定管中，同時在每個微量生化鑒定管添加5 μL 0.1 mg/mL的NAD，并設置對照管。37℃培養(yǎng)24 h后，觀察判定結(jié)果。 此外，將分離菌與金黃色葡萄球菌接種于無NAD的血平板上，兩種菌株垂直劃線培養(yǎng)，觀察有無溶血及衛(wèi)星現(xiàn)象[15]。

1.2.3 DNA提取及16 S rRNA PCR鑒定 將TSB中的菌液吸取1 mL放入滅菌1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心3 min，棄掉上清液，加入200 μL的滅菌蒸餾水，抽吸混勻后，100℃水浴8 min，取出后12 000 r/min離心2 min，取上清作為DNA模板。副豬嗜血桿菌16 S rRNA的引物設計參照宋帥等[16]的方法,上游引物:5′-GATGAGGAAGGGTGGTGT-3′;下游引物:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，預期擴增片段大小822 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。反應體系為20 μL：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模版2 μL，ddH2O 6μL。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4℃結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序，將測得的序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blastn搜索。

1.2.4 OmpP5基因的擴增和克隆 根據(jù)HaemophilusparasuisSH0165基因序列(GenBank登錄號：CP001321)用生物軟件Premier Primer5.0設計1對擴增副豬嗜血桿菌OmpP5基因片段的特異性引物，預期擴增目的片段大小為1 116 bp。上游引物(P1)序列為5′-CATGAAAAAATCTTTAATTGC-3′，下游引物(P2)序列為:5′-TTACATAGAAACTTCTTTTG-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。以測序結(jié)果為副豬嗜血桿菌的DNA作為模板，反應體系為20 μL：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模版2 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴增程序：94℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收OmpP5基因的PCR產(chǎn)物，進行和載體的連接，連接體系為5 μL，包括膠回收產(chǎn)物4 μL，Peasy-T5 Zero Cloning載體 1 μL。反應條件為25℃ 15 min。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入至剛解凍的Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞中，冰浴30 min后，42℃水浴熱激30 s，然后快速將管轉(zhuǎn)移至冰浴中2 min，之后加入250 μL的LB培養(yǎng)基，200 r/min 37℃培養(yǎng)1 h，取100 μL菌液涂布于含氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板上， 37℃培養(yǎng)12 h 后，挑取白色單個菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h。然后以堿裂解法小劑量制備質(zhì)粒, 并進行PCR鑒定, 將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

1.2.5 OmpP5核苷酸序列分析 將分離菌株的OmpP5核苷酸序列與GenBank上其他副豬嗜血桿菌參考株OmpP5序列用DNA Star中的MegAlign軟件進行核苷酸序列比對，分析同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定副豬嗜血桿菌阜新株OmpP5基因遺傳進化情況。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理變化

患病豬呼吸困難，關(guān)節(jié)腫大，體溫高達41.3℃，寒顫，精神沉郁，不喜食。剖檢后發(fā)現(xiàn)患病豬肺臟有化膿性纖維滲出物，心包積液、心包膜增厚粗糙，腹腔積液，肝脾腫大并與腹腔粘連，關(guān)節(jié)發(fā)生病變，有絮狀沉積物。

2.2 細菌分離純化及鏡檢結(jié)果

將TSA平板上生長出來的疑似Hps的菌落用接菌環(huán)挑出后繼續(xù)劃線培養(yǎng)18 h，生長出邊緣整齊、液滴狀、半透明、直徑約為1 mm的單一菌落后，進行革蘭染色，證實為革蘭陰性菌(圖1)，細菌形態(tài)呈現(xiàn)出短小桿狀，無芽胞，多單在，也有短鏈排列，長短不一的細菌形態(tài)(圖2)。

圖1 分離菌株在TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(400×)

圖2 分離菌株革蘭染色結(jié)果

2.3 生化試驗結(jié)果

將分離菌接入TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，用接種針沾取菌液接種到含有NAD的生化管中， 37℃培養(yǎng)18 h。結(jié)果顯示,分離菌株與副豬嗜血桿菌的生化特性相符(表1)。將分離菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時，未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，但產(chǎn)生了衛(wèi)星現(xiàn)象 (圖3)。

2.4 分離菌16 S rRNA 基因擴增結(jié)果

取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀中觀察顯示，目的條帶822 bp，與預期結(jié)果一致(圖4)。將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序后，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。結(jié)果顯示，與參考菌株Haemophilusparasuisstrain RU15-5P 16 S rRNA(GU226377.1)序列的同源性達99%，因此可以確定分離菌為Hps。

表1 分離菌株生化試驗結(jié)果

注：-.陰性;+.陽性。

Note:-.Negative;+.Positive.

圖3 分離菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象

M.DNA 標準DL 5 000;1.分離菌株16 S rRNA PCR擴增產(chǎn)物；2.ddH2O陰性對照；3.陽性對照

M.DNA Marker DL 5 000;1.16 S rRNA PCR amplification products；2.Negative control with H2O；3.Positive control

圖4分離菌株16 S rRNA PCR結(jié)果

Fig.4 PCR amplification results of the 16 S rRNA of the isolate

2.5 OmpP5基因擴增結(jié)果

提取分離菌DNA為模板，擴增其OmpP5基因，結(jié)果擴增到1 116 bp的目的條帶(圖5)。將目的條帶與載體連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)細胞中，并在含有氨芐抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，之后進行PCR鑒定，鑒定結(jié)果顯示擴增到1 116 bp的目的條帶(圖6)。

M.DNA 標準DL 5 000;1.分離菌株OmpP5 PCR擴增產(chǎn)物；2.ddH2O陰性對照

M.DNA Marker DL 5 000;1.OmpP5 PCR amplification products；2.Negative control with H2O

圖5分離菌株OmpP5基因的PCR擴增結(jié)果

Fig.5 PCR amplification results of the isolate OmpP5 gene

2.6 OmpP5基因序列比對及基因進化分析

將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中Nucleotide Blast進行比對分析。結(jié)果顯示，與Hps的OmpP5相匹配，與Hps參考菌株的同源性為89%～99%。利用DNA Star中的MegAlign功能對測得的序列與參考序列進行同源性比較和進化樹分析，結(jié)果顯示，分離株與№4菌株位于同一分支上，與參考菌株№4(EU741877.1)、SW140(EU741870.1)、SW114(EU741871.1)、131(EU741874.1)、SH0165(CP001321.1)、HS1072(FJ667986.1)、174(EU741875.1)、C5(HM172045.1)、D74(EU741869.1)、H367(HM172046.1)、H465(HM172047.1)、H425(HM172048.1)、SC030(HM747110.1)、IA-84-22113(HM172050.1)、SD-84-15995(HM172051.1)的同源性為89.8%～99.5%(圖7和圖8)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.分離菌株OmpP5 PCR擴增產(chǎn)物；2.ddH2O陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.OmpP5 PCR amplification products；2.Negative control with H2O

圖6重組質(zhì)粒OmpP5基因的PCR鑒定結(jié)果

Fig.6 PCR identification of recombinant plasmid OmpP5 gene

圖7 Hps分離株LNFX0225 OmpP5基因核苷酸序列同源性比較

圖8 Hps分離株LNFX0225 OmpP5基因核苷酸序列系統(tǒng)進化樹

3 討論

目前，Hps的分離還是比較困難的，原因在于Hps的生長要求比較苛刻，營養(yǎng)要求較高，生長速度慢。首次分離培養(yǎng)時需要環(huán)境中有體積分數(shù)為5%的CO2，體外培養(yǎng)時需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)以及50 mL/L的胎牛血清[17]。Hps與金黃色葡萄球菌在血平板共培養(yǎng)時能產(chǎn)“衛(wèi)星現(xiàn)象”的原因就是因為金黃色葡萄球菌能分泌Hps生長所需的NAD，使得金黃色葡萄球菌周邊的Hps生長良好，而稍遠處的Hps生長緩慢。研究表明，從病料分離該菌的最佳時間為12 h之內(nèi)[18]。正是由于這些培養(yǎng)特性，使得Hps的實際發(fā)病率遠遠高于臨床分離率。

Hps有15個血清型，另有20%是不能分型的。不同血清型致病力也不盡相同。近年來，根據(jù)Hps血清型的流行調(diào)查顯示，4、5及13型是國內(nèi)外主要流行血清型，東北地區(qū)主要流行5型和13型[19]。發(fā)病呈現(xiàn)季節(jié)性，一般秋冬季節(jié)高發(fā)。Hps除強毒株能夠引起發(fā)病外，中毒和弱毒株常與其他病原體混合感染，最常見的混合病原體有豬圓環(huán)病毒2型、豬肺炎支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒和豬呼吸道冠狀病毒等[20-21]。所以，防控本病除提高飼養(yǎng)管理水平外，還需做好其他病原體的免疫工作以及減少應激的發(fā)生。

本試驗所用的載體為pEASY-T5 Zero Cloning kit，該載體的特點是連接速度快，并且該載體能夠通過是否表達自殺基因來篩選陽性重組子。當片段與載體連接成功時，自殺基因無法表達，倒入感受態(tài)細胞后可以正常生長。當片段沒有與載體連接成功，載體導入感受態(tài)細胞后，自殺基因表達，導致感受態(tài)細胞不能存活。使用該載體可以略去藍白斑篩選試驗，減化了試驗的操作流程。

關(guān)于Hps毒力基因的報道已經(jīng)很多，現(xiàn)已確定Hps編碼的外膜蛋白OmpP5基因與該菌的黏附及定植相關(guān)，OmpP5蛋白能夠參與機體早期的免疫應答反應，給受體豬感染Hps菌液或注射滅活苗后均能檢測到OmpP5抗體，說明OmpP5蛋白可能成為疫苗的候選蛋白[22-23]。張斌等[24]在研究Hps外膜蛋白P5的免疫保護性時發(fā)現(xiàn)，OmpP5蛋白具有較強的抗原性和部分免疫保護作用。本研究對Hps遼寧株的OmpP5基因進行了鑒定并與Hps不同菌株的OmpP5基因進行了同源性比較及發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示，該分離株的OmpP5基因與№4在同一分支上，與所有參考菌株的同源性在89.7%～99.5%之間，并且與HS1072瑞士分離株、131日本分離株、C5菌株和№4菌株同源性均達到98%以上，說明OmpP5基因具有一定的保守性。至于毒力基因OmpP5的致病機理還需進一步研究。

[1] Bigas A,Garrido M E,Badiola I,et al.Colonization capacity and serum bactericidal activity ofHaemophilusparasuisthy mutants[J].Int Microbiol,2006,9(4):297-301.

[2] 江 軍,姜 平,王一成,等.浙江省副豬嗜血桿菌血清型調(diào)查及其潛在毒力相關(guān)基因分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2016,48(8):1-7.

[3] 李曦婷,王 超,薛彥杰,等.一例副豬嗜血桿菌的分離鑒定及16S rRNA生物信息學分析[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2016,47(4):438-444.

[4] Brockmeier S L,Register K B,Kuehn J S,et al.Virulence and draft genome sequence overview of multiple strains of the swine pathogenHaemophilusparasuis[J].PLoS One,2014,9(8):e103787.

[5] Dai K,Jin J,Wen Y P,et al.Complete genome sequence of highly virulentHaemophilusparasuisserotype 11 strain SC1401[J].Genome Announc,2016,4(4):e00628-00616.doi:10.1128/genomeA.00628-16.

[6] Vanier G,Szczotka A,Friedl P,et al.Haemophilusparasuisinvades porcine brain microvascular endothelial cells[J].Microbiology,2006,152(1):135-142.

[7] Cerda-Cuellar M,Aragon V.Serum-resistance inHaemophilusparasuisis associated with systemic disease in swine[J].Vet J,2008,175(3):384-389.

[8] Smith S G,Mahon V,Lambert M A,et al.A molecular Swiss army knife:OmpA structure,function and expression[J].FEMS Microbiol Lett,2007,273(1):1-11.

[9] Novinrooz A,Zahraei Salehi T,Firouzi R,et al.In-silico design,expression,and purify ication of novel chimericEscherichiacoliO157:H7 OmpA fused to LTB protein inEscherichiacoli[J].PLoS One,2017,12(3):e0173761.

[10] Macedo N,Cheeran M C,Rovira A,et al.Effect of enrofloxacin onHaemophilusparasuisinfection,disease and immune response[J].Vet Microbiol,2017,199:91-99.

[11] 陳小飛,張 斌,郭定乾,等.副豬嗜血桿菌血清型和外膜蛋白P5基因型多樣性的研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(2):143-146.

[12] Euba B,Moleres J,Viadas C,et al.Relative contribution of P5 and Hap surface proteins to nontypableHaemophilusinfluenzae interplay with the host upper and lower airways[J].PLoS One,2015,10(4):e0123154.

[13] Zhang B,Xu C,Zhou S,et al.Comparative proteomic analysis of aHaemophilusparasuisSC096 mutant deficient in the outer membrane protein P5[J]. Microb Pathog,2012,52(2):117-124.

[14] 樂 敏.副豬嗜血桿菌基因組學及毒力相關(guān)因子研究[D].湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學,2010.

[15] 蔣增海,徐耀輝,鄧同煒,等.副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學進展,2016,37(6):124-128.

[16] 宋 帥,李春玲,楊冬霞,等.副豬嗜血桿菌hhdA基因的鑒定和分析[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版,2011,37(3):291-301.

[17] 李曦婷.遼寧地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性研究[D].遼寧沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學,2017.

[18] 陳 勇,高 艷,張定全,等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與培養(yǎng)基篩選[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(10):67-71.

[19] Zhang J,Xu C,Guo L,et al.Prevalence and characterization of genotypic diversity ofHaemophilusparasuisisolates from southern China[J].Can J Vet Res,2012,76(3):224-229.

[20] Kavanová L,Prodělalová J,Nedbalcová K,et al.Immune response of porcine alveolar macrop hages to a concurrent infection with porcine reproductive and respiratory syndrome viru s andHaemophilusparasuisinvitro[J]. Vet Microbiol,2015,180(1-2):28-35.

[21] 左明開,曾文斌,劉悅欣,等. 豬藍耳病病毒、豬鏈球菌及副豬嗜血桿菌混合感染的診治[J].畜牧與獸醫(yī),2016,48(6):146-147.

[22] Olvera A,Pina S,Pérez-Simó M,et al.Virulence assoeiated trimeric autotran sporters ofHaemophilusparasuis are antigenic proteins expressedinvivo[J].Vet Res,2010,41(3):26.

[23] Zheng X,Yang X,Li X,et al.Omp16-based vaccine encapsulated by alginate-chitosan micros pheres provides significant protection againstHaemophilusparasuisin mice[J].Vaccine,2017;35(10):1417-1423.

[24] 張 斌,海 泉,湯 承,等.副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5的抗原特性研究[J].中國獸醫(yī)科學,2012,42(12):1230-1236.