苗書魁，魏玉榮，魏 婕，米曉云，汪 萍，馬文戈，王 延，薛 英，易 忠，黃 炯*

(1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830011；2．天康生物股份有限公司，新疆烏魯木齊 830030)

口蹄疫病毒的基因組為單股正鏈RNA，其RNA位于衣殼內(nèi)，約有8 500個核苷酸(nt)。反向遺傳(reverse genetics)操作技術(shù)可以對RNA病毒進(jìn)行遺傳操作，為RNA病毒的分子生物學(xué)研究提供了一種工具，這種技術(shù)具有較好的穩(wěn)定性，已在RNA病毒研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，該技術(shù)是目前FMDV基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的重要手段。據(jù)報道[2]，自1990年首次利用反向遺傳技術(shù)成功拯救O型FMDV至今，O[2]、A[3]、Asia1[4]和SAT2[5]等多個血清型的多株FMDV感染性克隆已被成功構(gòu)建。

FMDV分為SAT1、SAT2、SAT3、A、Asia1、O和C 7個血清型，型間無交叉保護(hù)反應(yīng)。FMDV O型分布比較廣泛，是世界口蹄疫的主要流行亞型。本研究以O(shè)型OHM/02株為親本株，擴(kuò)增獲得全長cDNA，利用EcoRV將全長cDNA重組質(zhì)粒pPO-1的3′末端線性化，與輔助質(zhì)粒(含有編碼T7 RNA聚合酶的真核表達(dá)重組質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，成功拯救出FMDV重組病毒，該拯救毒與親本毒感染性相似，為FMDV的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞 OHM/02毒株，新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所和天康生物股份有限公司共建的傳染病研究室保存；病毒培養(yǎng)液為含20 mL/L胎牛血清的DMEM液，當(dāng)細(xì)胞的CPE面積為70%左右時，將病毒于-70 ℃保存；BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感受態(tài)大腸埃希菌DH5α和pUC57載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶，Thermo公司產(chǎn)品；Trizol Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Cat.Not.04896866001)，Roche公司產(chǎn)品；PrimeSTAR DNA聚合酶、Prime Script○ROne Step RT-PCR Kit Ver.2，TaKaRa公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Effectene○RTransfection Reagent，自QIAGEN公司產(chǎn)品；一抗為O型FMDV豬陽性血清，天康生物股份有限公司提供；二抗為FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與基因合成 根據(jù)已知O型FMDV全基因組序列(GenBank：AJ539138)，采用Oligo 6.0軟件，將毒株全基因組分為7個重疊的片段，設(shè)計(jì)合成7對引物(表1，1-7)，擴(kuò)增全基因組序列。測序拼接后得到毒株全基因組真實(shí)序列，將該真實(shí)序列分為5個重疊的片段，相應(yīng)地設(shè)計(jì)合成5對引物(表1，A-E)用于全序列擴(kuò)增，同時設(shè)計(jì)2對用于引入分子標(biāo)簽的引物(表1，F(xiàn)系列)。全長cDNA3′末端下游引物ER中加入EcoRV酶切位點(diǎn)，用于全基因組cDNA的線性化。

表1 病毒基因組全長cDNA擴(kuò)增和鑒定引物

合成一段含酶切位點(diǎn)的序列(-SpeⅠ-SphⅠ-T7-XbaⅠ-NotⅠ-SmaⅠ-MluⅠ-EcoRV-SpeⅠ-)：TATACTAGT(SpeⅠ)ATAGCATGC(SphⅠ)TAATACGACTCACTATAGGG(T7)TCTAGA(XbaⅠ)GCAGCGGCCGC(NotⅠ)TAAACCCGGG(SmaⅠ)GGAACGCGT(MluⅠ)ATAGATATC(EcoRV)AATACTAGT(SpeⅠ)ATA，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

1.2.2 病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄 病毒RNA提取采用Trizol試劑，反轉(zhuǎn)錄過程按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明書操作。

張同波：從十年九虧的軍工企業(yè)到現(xiàn)在總產(chǎn)能為800萬t的鋼鐵制品綜合加工上市企業(yè)，新興鑄管走過了一段艱難的歷程。新興鑄管股份有限公司的前身是2672工廠，這是20世紀(jì)70年代為了解決鐵道兵鋼材短缺經(jīng)中央軍委批準(zhǔn)興建的，隸屬于鐵道兵，鐵道兵撤編后劃歸總后勤部。1996年，隨著我國國有企業(yè)轉(zhuǎn)制，工廠改制為新興鑄管（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，也就是現(xiàn)在新興際華集團(tuán)的前身。1997年6月，由集團(tuán)公司獨(dú)家發(fā)起募集設(shè)立新興鑄管股份有限公司，其股票在深交所上市。

1.2.3 全長cDNA的構(gòu)建 改造載體pUC57,設(shè)計(jì)一對上、下游分別含SpeⅠ酶切位點(diǎn)的引物，通過PCR缺失多克隆位點(diǎn)，則載體pUC57中含有個SpeⅠ酶切位點(diǎn)。

對覆蓋全基因組的7個重疊片段擴(kuò)增及測序，得到OHM/02毒株全基因組真實(shí)序列。對真實(shí)序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)拼接策略。將先合成的含酶切位點(diǎn)的序列(-SpeⅠ-SphⅠ-T7-XbaⅠ-NotⅠ-SmaⅠ-MluⅠ-EcoRV-SpeⅠ-)與改造的載體pUC57分別用SpeⅠ酶切，然后將該序列克隆至改造的載體pUC57中，構(gòu)建試驗(yàn)所需的載體pUC57-SpeⅠ-SpeⅠ。

PCR擴(kuò)增5個相互重疊片段(A、B、C、D和E)，測序鑒定正確后，按照A、D、E、B、C的順序，分別雙酶切后依次克隆至載體pUC57-SpeⅠ-SpeⅠ中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒，酶切及測序鑒定得到陽性質(zhì)粒(圖1)。將構(gòu)建的全長cDNA克隆命名為pPO-1。用EcoRV將其酶切線性化，純化后置-20℃保存。

圖1 FMDV基因組拼接策略示意圖

1.2.4 T7 RNA聚合酶的真核質(zhì)粒pT7RNAP的構(gòu)建 以BL21(DE3)細(xì)菌為模板，上游引物T7RNAP-F：5′-CTGGGATCCACCATGAACACGATTAACATCGC-3′；下游引物T7RNAP-R：5′-CTGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCGACTC-3′，PCR擴(kuò)增T7 RNA聚合酶基因，克隆至表達(dá)載體pcDNA3.1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT7RNAP。

1.2.5 轉(zhuǎn)染 待單層BHK-21細(xì)胞面積約75%時，取線性化的pPO-1和pT7RNAP質(zhì)粒各2 μg，參照Effectene○RTransfection Reagent轉(zhuǎn)染。同時設(shè)正常細(xì)胞對照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，加入含80 mL/L胎牛血清的DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，將病毒液反復(fù)凍融3次，在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代，當(dāng)出現(xiàn)典型的CPE時，病毒液置-70℃保存。

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 拯救病毒和親本病毒分別接種于96孔板中的BHK-21細(xì)胞，設(shè)正常細(xì)胞作為陰性對照，培養(yǎng)12 h，用預(yù)冷的無水乙醇固定，漂洗并吸盡殘液，加入FMDV豬陽性血清(1∶20)，置濕盒中1 h，用PBS洗滌，加FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG (1∶200)，置濕盒孵育50 min，再用PBS洗滌后于倒置熒光顯微鏡下觀察，Nikon成像系統(tǒng)拍照。

1.2.7 病毒粒子的電鏡觀察 取拯救病毒感染的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物1 mL，加入FMDV豬陽性血清，37℃溫育2 h，置4℃過夜，12 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用100 μL PBS溶解后負(fù)染色，電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。

1.2.8 拯救病毒的生長曲線 待BHK-21細(xì)胞長滿單層時，分別將拯救病毒和親本病毒按105TCID50進(jìn)行接種，置37℃吸附1 h，用PBS洗滌細(xì)胞，吸盡殘液，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在接種后第2、4、6、8、10、12、14 h分別收獲病毒。用Reed-Muench計(jì)算病毒TCID50，繪制病毒生長曲線，比較兩種病毒的增殖特性。

2 結(jié)果

2.1 FMDV全長cDNA的構(gòu)建

RT-PCR擴(kuò)增獲得5個相互重疊的片段(A、B、C、D和E)，按照A、D、E、B、C的順序，分別雙酶切并依次連接入載體pUC57-SpeⅠ-SpeⅠ。經(jīng)序列測定驗(yàn)證所構(gòu)建的全長cDNA序列完全符合預(yù)期設(shè)計(jì)。并且構(gòu)建的感染性克隆中7 501 bp處限制性酶切位點(diǎn)BamHⅠ的堿基C被替換為T，可作為區(qū)分拯救病毒和親本病毒的分子標(biāo)記。

2.2 FMDV的拯救

轉(zhuǎn)染64 h后可見CPE，細(xì)胞收縮變圓、脫落、逐漸崩解、形成碎片(圖2A)。收獲病毒并繼續(xù)傳代，則出現(xiàn)CPE的時間逐代變短，病變愈加明顯。當(dāng)傳至第5代時，12 h即可出現(xiàn)明顯CPE，70%細(xì)胞變圓、脫落；而對照細(xì)胞形態(tài)正常，未見收縮變圓等特點(diǎn)(圖2B)。

2.3 分子標(biāo)記的驗(yàn)證

序列測定表明，該病毒基因組在7 501 bp處具有酶切位點(diǎn)BamHⅠ，為了區(qū)別親本毒株，在構(gòu)建全長cDNA克隆時已將7 501位BamHⅠ敲除。選用鑒定拯救病毒分子標(biāo)簽的引物DF和ER，對拯救病毒和親本毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物膠回收后用BamHⅠ酶切，12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明，拯救病毒的PCR產(chǎn)物不能被切開，大小約1 000 bp的1個條帶，而親本毒株的PCR產(chǎn)物被切成預(yù)期大小為241 bp和760 bp的2個條帶，這符合預(yù)期結(jié)果(圖3A)。同時，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后測序，結(jié)果證明，親本毒株的BamHⅠ酶切位點(diǎn)存在(圖3B)，而拯救病毒基因中該位點(diǎn)消失(圖3C)。所以，排除了拯救病毒過程中親本毒株污染的可能性。

圖2 拯救病毒感染的BHK-21細(xì)胞(A)和正常BHK-21細(xì)胞(B)(200×)

2.4 間接免疫熒光檢測

通過間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在拯救病毒(圖4A)和親本病毒(圖4B)感染的BHK-21細(xì)胞中均觀察到特異性免疫熒光，而正常BHK-21 (圖4C)細(xì)胞無特異性熒光。

2.5 病毒粒子的電鏡觀察

拯救的FMDV負(fù)染后，在電鏡下可觀察到病毒粒子，為球形，散在分布，直徑約25 nm～30 nm(圖5)。

2.6 病毒生長曲線

為了比較拯救病毒和親本病毒的復(fù)制能力和增殖特性，制作病毒生長曲線。由圖6可知，2種病毒的復(fù)制能力和增殖特性相似。

2.7 感染性克隆的穩(wěn)定性

將感染性克隆pPO-1在DH5α中連續(xù)傳10次后，對其全基因組測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有任何堿基的缺失或突變，說明該重組質(zhì)粒在DH5α中高度穩(wěn)定；此外，將拯救病毒在BHK-21細(xì)胞中連續(xù)接種傳代，在第5代后，病變時間趨于穩(wěn)定，與親本病毒出現(xiàn)CPE的時間接近。因此，該反向遺傳系統(tǒng)是穩(wěn)定的。

A.RT-PCR產(chǎn)物BamHⅠ酶切鑒定;B.有BamHⅠ酶切位點(diǎn);C.BamHⅠ酶切位點(diǎn)消失;1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 20 000;2.拯救病毒;3.親本病毒

A.RT-PCR fragment digested withBamHⅠ;B.BamHⅠ site;C.DeletedBamHⅠ site;1.DNA Marker DL 20 000;2.Rescued virus;3.Parental virus

圖3拯救病毒分子標(biāo)簽的鑒定

Fig.3 Identification of the rescued virus byBamHⅠ digestion

A.拯救病毒感染的BHK-21細(xì)胞；B.親本病毒感染的BHK-21細(xì)胞；C.正常BHK-21細(xì)胞(100×)

A.BHK-21 cells infected with the rescued virus(200×)；B.BHK-21 cells infected with the parental virus(100×)；C.Normal BHK-21 cells(100×)

圖4拯救病毒感染BHK-21細(xì)胞的免疫熒光檢測(100×)

Fig.4 Identification of rescued FMDV in BHK-21 cells by IF assay(100×)

圖5 口蹄疫病毒粒子的免疫電鏡觀察(80 000×)

圖6 拯救病毒和親本病毒的生長曲線

3 討論

反向遺傳操作是從克隆的cDNA產(chǎn)生感染性RNA病毒的過程，實(shí)現(xiàn)在cDNA水平上對RNA病毒的人工操作，為RNA病毒研究提供了重要的手段，從而達(dá)到研究病毒結(jié)構(gòu)與功能的目的。FMDV是單股正鏈的RNA病毒，利用反向遺傳操作技術(shù)能夠在DNA水平上對病毒基因組進(jìn)行人工操作[6]。目前對Asia1型[4，7-9]、A型[10-11]和O型[12-15]口蹄疫病毒的拯救均有報道，但對O型OHM/02毒株建立感染性克隆的研究尚未見報道。

本研究采用OHM/02毒株，通過基因組全序列分段擴(kuò)增和拼接，與含有編碼T7RNA聚合酶的真核表達(dá)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，成功構(gòu)建了O型口蹄疫病毒cDNA感染性克隆，為更加深入地探索FMDV的基因功能、致病機(jī)理、毒力變異機(jī)制等搭建了技術(shù)平臺。

病毒感染性克隆的構(gòu)建一定要獲得高質(zhì)量的病毒RNA，才能準(zhǔn)確擴(kuò)增病毒全長cDNA。FMDV為RNA病毒，由于RNA病毒種的特性，導(dǎo)致難于獲得其真實(shí)序列。病毒基因組的真實(shí)序列對感染性克隆的構(gòu)建至關(guān)重要，為了得到基因組的真實(shí)序列，在試驗(yàn)中選擇了保真性高的反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，PCR時將擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)為25個，以此盡量減少堿基的錯配率；測序時每個片段的陽性克隆均選7個質(zhì)粒。

poly(C)長度對FMDV復(fù)制能力具有很大的影響，在不同的病毒拯救試驗(yàn)中，其影響各不相同。據(jù)Zibert A等[2]報道，poly(C)的長度至少在35個堿基以上，構(gòu)建的FMDV cDNA才具有感染性；而Rieder E等[15]認(rèn)為，poly(C)的長度為2時FMDV的感染性同樣存在，poly(C)的長度大于6時，A型FMDV的滴度可達(dá)到自然毒水平。另有人提出，O型FMDV poly(C) 的核苷酸長度為15、17、29個時，均能構(gòu)建感染性cDNA[16]。本研究中構(gòu)建的O型FMDV感染性cDNA含18個C，也具有感染性。

poly(A)尾不但具有穩(wěn)定病毒基因組結(jié)構(gòu)的功能，而且對維持其感染性也有一定的作用[17]。poly(A)尾的長度與感染性的關(guān)系一直存在爭議。有人認(rèn)為poly(A)的長度越長越好，也有人認(rèn)為長或短在感染性上沒有區(qū)別[7]。本試驗(yàn)中在毒株3′ 端擴(kuò)增出22個A，成功地構(gòu)建了感染性cDNA，可見poly(A)長度與感染性的關(guān)系不是確定的，不是越長越好，或越短越好，而是依毒株而定。同時，在T7啟動子的核心序列與基因組之間添加了2個G，以期提高體內(nèi)轉(zhuǎn)錄效率。

在病毒拯救中，體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)存在許多缺陷(如操作繁瑣、拯救效率低和RNA容易降解等)而導(dǎo)致病毒拯救效率低。但體內(nèi)轉(zhuǎn)錄卻具有操作簡單、可獲得穩(wěn)定的RNA、試劑價格相對便宜、病毒基因在表達(dá)時不需依靠病毒的復(fù)制過程等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用。本研究將線性化的全長cDNA重組質(zhì)粒pPO-1與表達(dá)T7 RNA聚合酶真核質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，獲得了拯救的病毒。也有人利用此方法成功地構(gòu)建了感染性克隆[8,12,18]，說明該方法行之有效，在病毒拯救中可供選用。

[1] Strohmaier K,Franze R,Adman K,et al.Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunization protein[J].J Gen Virol,1982，59(2):295-306.

[2] Zibert A,Maass G,Strebel K,et al.Infectious foot-and-mouth disease virus derived from a cloned full-length cDNA[J].J Virol,1990,64:2467-2473.

[3] Rieder E,Henry T,Duque H,et al.Analysis of a foot-and-mouth disease virus type A24 isolate containing an SGD receptor recognition siteinvitroand its pathogenesis in cattle[J].J Virol,2005,79:12989-12998．

[4] 王海偉，涂亞斌，周國輝，等.Asia1型口蹄疫病毒感染性克隆的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，30(12)：915-919．

[5] Van Rensburg H G,Henry T M,Mason P W.Studies of genetically defined chimeras of a European type A virus and a South African Territories type 2 virus reveal growth determinants for foot-and-mouth disease virus[J].J Gen Virol,2004,85:61-68．

[6] Boyer J C,Haenni A L.Infectious transcripts and cDNA clone of RNA virus[J].Virology,1994,198:415-426.

[7] 李 爽，張潤祥 ，宋 鴿，等．牛Asia1 型口蹄疫病毒感染性克隆的構(gòu)建[J].生物工程學(xué)報，2009，25(11)：1621-1626．

[8] 李平花，白興文，盧曾軍，等．細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄拯救Asia1型口蹄疫病毒[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(2)：688-693．

[9] 李平花，白興文，孫 普，等．Asial型口蹄疫病毒含RSD受體識別位點(diǎn)感染性克隆的構(gòu)建與病毒拯救[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42(2)：210-216．

[10] 袁子文，李平花，孫 普，等．一株A型口蹄疫流行毒株全序列的測定及其全長感染性克隆的構(gòu)建[J].微生物學(xué)通報，2016，43(9)：2019-2027．

[11] Bai X W,Li P H,Cao Y M,et al,Engineering infectious foot-and-mouth disease virus in vivo from a full-length genomic cDNA clone of the A/AKT/58 strain[J].Sci China Series C:Life Sci,2009,52(2):155-162.

[12] 楊德成，涂亞斌，王海偉，等．O型泛亞譜系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31(1)：1-5，15．

[13] 曹偉軍，李平花，白興文，等．口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010，25(3)：32-37．

[14] 盧受昇，趙啟祖，劉湘濤，等．口蹄疫病毒O/QYYS/s/06株感染性克隆的構(gòu)建[J].生物工程學(xué)報，2009，25(7)：982-986．

[15] Hema M,Chandran D,Nagendrakumar S B,et al.Construction of an infectious cDNA clone of foot-and-mouth disease virus type O1BFS 1860 and its use in the preparation of candidate vaccine[J].J Biosci,2009,34(1):45-58.

[16] Rieder E,Bunch T,Brown F,et al.Genetically engineered foot-and-mouth disease viruses with poly(c) tracts of two nucleotide are virulent in mice[J].J Virol,1993,67(9):5139-5145.

[17] Barry B,Marvin J G,Howard L B.The relation of poly(a) length to specific of viral RNA:A comparison of different types of foot and mouth disease virus[J]. Virology,1979,98(2):480-483.

[18] Witko S E,Kotash C S,Nowak R M,et al.An efficient helper-virus-free method for rescue of recombinant paramyxoviruses and rhadoviruses from a cell line suitable for vaccine development[J].J Virol Meth,2006,135:91-101.