孫秋艷，沈美艷，朱明恩，李 舫

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061)

滸苔(Enteromorpha)俗稱苔條、海苔，是綠藻石莼科中的水生藻類植物，滸苔多糖(Enteromorphapolysaccharide，EPS)是滸苔的關(guān)鍵活性成分[1]，研究表明，滸苔多糖具有免疫調(diào)節(jié)的功能[2-4]。然而，EPS對(duì)雞的免疫增強(qiáng)效果鮮有報(bào)道。為了探討EPS對(duì)雞的免疫增強(qiáng)效果，本試驗(yàn)首先給雞注射不同含量的EPS，然后接種ND La Sota+IB H120二聯(lián)弱毒疫苗，通過(guò)測(cè)定抗體滴度、sIgA含量、免疫器官指數(shù)、外周血中淋巴細(xì)胞比率、血清中IL-2和IFN-γ的含量來(lái)評(píng)價(jià)EPS免疫增強(qiáng)效果，為進(jìn)一步開發(fā)EPS作為新型免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和疫苗 IBV H120(infectious bronchitis H52)毒株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。ND La Sota+IB H120二聯(lián)弱毒疫苗，齊魯動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品(生產(chǎn)批號(hào)：150252038)。

1.1.2 主要試劑 雞新城疫病毒HI試驗(yàn)用抗原、陽(yáng)性血清與陰性血清，青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品(生產(chǎn)批號(hào)：150138082)；雞分泌型IgA(sIgA)ELISA試劑盒，上海美旋生物科技公司產(chǎn)品；IL-2 ELISA試劑盒、IFN-γ ELISA試劑盒，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 滸苔多糖制備 新鮮滸苔8月份采自青島海域，按照水煮醇沉法提取，分離純化后EPS含量為69.2%，置-20℃保存，使用時(shí)按試驗(yàn)要求進(jìn)行稀釋。

1.2.2 動(dòng)物處理 1日齡雄性SPF白羽雞，購(gòu)自山東濟(jì)南SPAFAS雞場(chǎng)，試驗(yàn)期間所用雞均在山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院的SPF動(dòng)物房嚴(yán)格按照SPF雞飼養(yǎng)管理要求進(jìn)行飼養(yǎng)。將192只1日齡SPF雞隨機(jī)分成4組，每組48只。Ⅰ～Ⅲ組在2日齡頸部皮下注射滸苔多糖，滸苔多糖含量分別為20、30、40 g/L，Ⅳ組注射生理鹽水，劑量均為0.1 mL/只，連續(xù)3 d。各組于7、21 d分別點(diǎn)眼滴鼻1頭羽份的新城疫-雞傳染性支氣管炎(ND La Sota+IB H120株)二聯(lián)弱毒疫苗。分別于免疫接種后7、14、21、28、35、42、49、56 d從每組隨機(jī)抽取6只雞，檢測(cè)前禁食禁水6 h，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 血清中NDV和IBV抗體滴度的測(cè)定 無(wú)菌采集雞心臟血2.0 mL注入離心管中，25℃、3 000 r/min離心20 min，取上清，采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 1655—2008)中的血凝抑制試驗(yàn)(HI)進(jìn)行NDV抗體滴度的檢測(cè)。采用中和試驗(yàn)(固定病毒稀釋血清方法)進(jìn)行IBV抗體滴度檢測(cè)。記錄結(jié)果均為n lg2。

1.2.4 小腸內(nèi)sIgA含量的測(cè)定 剪取十二指腸至空腸段的雞小腸10 cm，用無(wú)菌生理鹽水將內(nèi)容物沖洗干凈，加3 mL含1 g/L牛血清白蛋白和蛋白酶抑制劑的PBS(pH7.2)，室溫下孵育5 h后勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液備用，按照雞分泌型IgA(sIgA)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 免疫器官指數(shù)的測(cè)定 每組雞稱體重，取法氏囊、脾臟和胸腺，用無(wú)菌濾紙吸取表面水分后，分別稱重，重量與體重之比即為免疫器官指數(shù)。

1.2.6 淋巴細(xì)胞比率的測(cè)定 用EDTA-Na真空無(wú)菌采血管采集雞心臟血1 mL，用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血液內(nèi)淋巴細(xì)胞比率。

1.2.7 血清中IL-2和IFN-γ含量的測(cè)定 無(wú)菌采集雞心臟血2.0 mL注入離心管中，37℃靜置1 h，4 000 r/min離心15 min，取上清，置-20℃保存?zhèn)溆?，按照IL-2 ELISA試劑盒和IFN-γ ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行IL-2和IFN-γ含量的測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 血清中NDV和IBV抗體滴度的變化

各組血清中NDV、IBV抗體滴度變化見表1和表2。結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅲ組血清中NDV、IBV抗體滴度顯著高于Ⅳ組(P<0.05)；Ⅱ組血清中NDV、IBV抗體滴度極顯著高于Ⅳ組(P<0.01)，顯著高于Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05)；Ⅲ組血清中NDV、IBV抗體滴度顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；各組血清中NDV、IBV抗體滴度均在免疫后21 d達(dá)到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d時(shí)抗體滴度達(dá)到最高水平，56 d開始下降，高水平抗體滴度維持時(shí)間較長(zhǎng)。

2.2 小腸內(nèi)sIgA含量的變化

各組小腸內(nèi)sIgA含量變化結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅲ組小腸內(nèi)sIgA含量極顯著高于Ⅳ組(P<0.01)；Ⅱ組小腸內(nèi)sIgA含量顯著高于Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)；Ⅲ組小腸內(nèi)sIgA含量顯著高于Ⅰ(P<0.05)；各組小腸內(nèi)sIgA含量均在免疫后21 d達(dá)到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d時(shí)達(dá)到最高峰，56 d開始下降(圖1)。

2.3 免疫器官指數(shù)的變化

各組免疫器官指數(shù)的變化結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅲ組的胸腺、法氏囊指數(shù)顯著高于Ⅳ組(P<0.05)，脾臟指數(shù)極顯著高于Ⅳ組(P<0.01)；Ⅱ組胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)顯著高于Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)；Ⅱ組各免疫器官指數(shù)均極顯著高于Ⅳ組(P<0.01)(圖2)。

2.4 淋巴細(xì)胞比率的變化

各組外周血淋巴細(xì)胞比率的變化結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅲ組外周血淋巴細(xì)胞比率顯著高于Ⅳ組(P<0.05)；Ⅰ～Ⅲ組外周血淋巴細(xì)胞比率差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

表1 血清中NDV抗體滴度的變化

注：Ⅰ～Ⅲ組為滸苔多糖試驗(yàn)組，滸苔多糖含量分別為20、30、40 g/L，分別用20 EPS、30 EPS、40EPS表示，Ⅳ為生理鹽水對(duì)照組。同列角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Ⅰ～Ⅲ groups were EPS groups,the contents of EPS were 20,30,40 g/L respectively,20 EPS，30 EPS，40EPS were Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ groups，Ⅳ was normal saline control.The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and different small letters mean significant difference(P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

表2 血清中IBV抗體滴度的變化

注：Ⅰ～Ⅲ組為滸苔多糖試驗(yàn)組，滸苔多糖含量分別為20、30、40 g/L，分別用20 EPS、30 EPS、40EPS表示，Ⅳ為生理鹽水對(duì)照組。同列角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Ⅰ～Ⅲ groups were EPS groups,the contents of EPS were 20,30,40 g/L respectively,20 EPS，30 EPS，40EPS were Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ groups，Ⅳ was normal saline control.The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and different small letters mean significant difference(P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

圖1 小腸內(nèi)sIgA含量的變化

2.5 外周血中IL-2含量的變化

各組外周血中IL-2含量的變化結(jié)果顯示,Ⅰ～Ⅲ組外周血中IL-2含量極顯著高于Ⅳ組(P<0.01)；Ⅱ組外周血中IL-2含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅰ～Ⅲ組外周血中IL-2含量差異不顯著(P>0.05)；所有組外周血中IL-2含量均在免疫后21 d達(dá)到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d時(shí)抗體滴度達(dá)到最高水平，56 d開始下降(圖4)。

2.6 外周血中IFN-γ含量的變化

各組外周血中IFN-γ含量的變化結(jié)果顯示,Ⅰ～Ⅲ組外周血中IFN-γ含量極顯著高于Ⅳ組(P<0.01)；Ⅱ組外周血中IFN-γ含量顯著高于Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)；所有組外周血中IFN-γ含量均在免疫后21 d達(dá)到高峰，28 d略有下降，然后迅速回升，49 d時(shí)抗體滴度達(dá)到最高水平，56 d開始下降(圖5)。

3 討論

機(jī)體血清抗體效價(jià)的變化能夠準(zhǔn)確、直觀地反映體液免疫的狀態(tài)[5]，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)組血清中NDV、IBV抗體滴度顯著高于Ⅳ(NS)組(P<0.05)；Ⅱ組血清中NDV、IBV抗體滴度極顯著高于Ⅳ組(P<0.01)，顯著高于Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05),表明EPS可以顯著提高血清抗體滴度。

法氏囊、胸腺和脾臟是雞的主要免疫器官，這些免疫器官的發(fā)育狀況及機(jī)能強(qiáng)弱直接決定禽類免疫水平[6]。本試驗(yàn)將雞的法氏囊、胸腺和脾臟重量與體重之比作為免疫器官指數(shù)的指標(biāo)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)組的胸腺、法氏囊指數(shù)顯著高于Ⅳ組(P<0.05)，脾臟指數(shù)極顯著高于Ⅳ(NS)組(P<0.01)；Ⅱ組胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)顯著高于Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)，極顯著高于Ⅳ(NS)組(P<0.01),表明EPS對(duì)提高雞免疫器官生長(zhǎng)有一定程度促進(jìn)作用。

A.胸腺;B.法氏囊;C.脾臟

A.Thymus;B.Bursa;C.Spleen

圖2免疫器官指數(shù)的變化

Fig.2 Changes of immune organ indexes

圖3 外周血中淋巴細(xì)胞比率變化

圖4 外周血中IL-2含量的變化

圖5 外周血中IFN-γ含量的變化

小腸sIgA 含量能夠反映體液免疫的狀態(tài)，本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)組小腸內(nèi)sIgA含量極顯著高于Ⅳ(NS)組(P<0.01)；Ⅱ組小腸內(nèi)sIgA含量顯著高于Ⅰ、Ⅲ組(P<0.05)；Ⅲ組小腸內(nèi)sIgA含量顯著高于Ⅰ(P<0.05),表明EPS可以增強(qiáng)疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生sIgA的量。

淋巴細(xì)胞在機(jī)體的免疫應(yīng)答中具有舉足輕重的作用，是反映細(xì)胞免疫的直接指標(biāo)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)組外周血淋巴細(xì)胞比率顯著高于Ⅳ(NS)組(P<0.05)，表明EPS對(duì)外周血淋巴細(xì)胞比率具有促進(jìn)作用。

輔助T淋巴細(xì)胞(Th)是適應(yīng)性免疫中非常重要的T淋巴細(xì)胞[8]，能夠釋放促炎細(xì)胞因子。識(shí)別抗原后，激活的Th細(xì)胞根據(jù)功能和分泌細(xì)胞因子的差異可分為Th1、Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞能夠分泌IL-2和IFN-γ，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[9-10]。因此外周血中IL-2和IFN-γ的含量可以間接反映細(xì)胞免疫的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ～Ⅲ(20 EPS、30 EPS、40 EPS)組外周血中IL-2、IFN-γ含量極顯著高于Ⅳ(NS)組(P<0.01)，表明EPS可提高外周血中IL-2、IFN-γ的含量。

綜上說(shuō)明，EPS對(duì)ND La Sota+IB H120二聯(lián)弱毒疫苗免疫效果具有明顯增強(qiáng)作用，可以增強(qiáng)雞的免疫力，因此EPS可作為免疫增強(qiáng)劑進(jìn)行開發(fā)。

[1] Cui Z,Meng S,Jiang S,et al.Serological surveys of chicken anemia virus,avian reticuloendotheliosis virus and avian reovirus infections in white meat-type chickens in China[J].Acta Vet Zootech Sin,2006,37:152-157.

[2] Wei J,Wang S,Liu G,et al.Polysaccharides fromEnteromorphaproliferaenhance the immunity of normal mice[J].Int J Biol Macromol,2014,64:1-5．

[3] Shao P,Pei Y,Fang Z,et al.Effects of partial desulfation on antioxidant and inhibition of DLD cancer cell ofUlvafasciatapolysaccharide[J].Int J Biol Macromol,2014,65(4):307-313.

[4] Teng Z,Qian L,Zhou Y.Hypolipidemic activity of the polysaccharides fromEnteromorphaprolifera[J].Int J Biol Macromol,2013,62(11):254-256.

[5] 左雪梅，崔國(guó)林，楊世發(fā)，等.泰山松花粉多糖和乳酸桿菌對(duì)禽波氏桿菌OMP亞單位疫苗免疫增強(qiáng)的協(xié)同作用[J]．中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33(11):1662-1667．

[6] Chattopadhyay G,Chen Q,Colina J,et al.Intact bacteria inhibit the induction of humoral immune responses to bacterial-derived and heterologous soluble T cell-dependent antigens[J].J Immunol,2009,182(4):2011-2019.

[7] Montzouris K C,Tsirtsikos P,Kalamara E,et al.Evaluation of the efficacy of a probiotic containingLactobacillus,Bidobacterium,Biterococcus,andPediococcusstrains in promoting broiler performance and modulating cecal microflora composition and metabolic activities[J].Poult Sci,2007,86:309-317.

[8] Li C H,Santoso S,Lo D D.Quantitative analysis of T cell homeostatic proliferation[J].Cell Immunol,2007,250(1-2)：45-54.

[9] Kuang H,Xia Y,Liang J,et al．Structural characteristics of a hyperbranched acidic poly-saccharide from the stems of Ephedra sinica and its effect on T-cell subsets and their cytokines in DTH mice[J].Carbohydrate Polymers,2011,86(4):1705-1711．

[10] 余 強(qiáng).黑靈芝多糖的免疫調(diào)節(jié)活性及其作用機(jī)制[D].江西南昌：南昌大學(xué)，2014．