李珊珊，王悅竹，宋一帆，白雪峰

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)醫(yī)學(xué)信息學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

0 引言

心血管病患病率及死亡率仍將不斷上升，而其中尤其嚴(yán)重的是急性心肌梗塞。臨床上急性心肌梗死發(fā)病率高，預(yù)后多不良，已經(jīng)引起醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)是全球范圍內(nèi)指致死和致殘的主要疾病之一。

國(guó)內(nèi)外對(duì)心肌梗死的生物學(xué)標(biāo)志進(jìn)行了大量而廣泛的研究。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在心肌梗死中更為靈活的調(diào)控多個(gè)mRNA在通路中的異常表達(dá)。

研究證實(shí)，有些lncRNA通過靶向作用于其他基因參與調(diào)控病理性心肌細(xì)胞凋亡[1]，有些lncRNA在梗死組織中被發(fā)現(xiàn)通過抑制其表達(dá)可以減弱心肌梗死[2-3]。還有些在外周血中被發(fā)現(xiàn)這些lncRNA可能在AMI的發(fā)展中具有潛在作用[4-5]。lncRNA還可作為 ceRNA參與調(diào)控細(xì)胞死亡，Wang等[6]發(fā)現(xiàn)了一種lncRNA APF(autophagy promoting factor)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。人體發(fā)生急性心肌梗塞后體內(nèi)的mRNAs和lncRNAs表達(dá)異常，通過轉(zhuǎn)錄后水平參與MI及其并發(fā)癥的病理生理過程，有望成為急性心肌梗死新的生化標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

本文根據(jù)mRNA與lncRNA的概述以及近年來心肌梗塞與mRNA和lncRNA的相關(guān)研究進(jìn)程來討論mRNA-lncRNA相互作用的調(diào)控機(jī)制對(duì)心肌梗死發(fā)生與發(fā)展過程的影響，為研究者在mRNAs、lncRNAs和AMI診斷方面的研究提供幫助。

1 lncRNA與心肌梗塞

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

我們從NCBI上下載平臺(tái)數(shù)據(jù)（GPL96）、基因芯片數(shù)據(jù)（GSE974）和GENECODE數(shù)據(jù)庫中下載人類的基因序列，利用計(jì)算機(jī)軟件建庫比對(duì)，對(duì)lncRNA與mRNA進(jìn)行分離。芯片數(shù)據(jù)包括38個(gè)病人樣本（16 normal/22 MI），對(duì)平臺(tái)數(shù)據(jù)進(jìn)行探針重注釋得出11083個(gè)mRNA和382個(gè)lncRNA。通過SAM算法選取差異基因，通過R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)處理選取的差異的mRNA和lncRNA（foldchange＞2）,得到了9937個(gè)差異mRNA和86個(gè)差異lncRNA。這些差異表達(dá)的mRNA和lncRNA作為心肌梗死的潛在致病因素。利用R語言構(gòu)出mRNA與lncRNA互做網(wǎng)絡(luò)（pearson＞0.8）用Cytoscape插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊挖掘，獲得5個(gè)功能顯著性模塊，最后通過David進(jìn)行基因的功能注釋，結(jié)果見圖1。

1.2 表達(dá)譜網(wǎng)絡(luò)分析

得到mRNA-lncRNA互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)點(diǎn)數(shù)1309個(gè)，其中包含1276個(gè)mRNA和33個(gè)lncRNA，1680條邊。網(wǎng)絡(luò)圖中的點(diǎn)代表基因，邊表示兩個(gè)基因間的聯(lián)系，其中度越大的基因表示與其連接的基因越多，表明在網(wǎng)絡(luò)中可能起著重要作用。另外，還存在一些雖然度小但在網(wǎng)絡(luò)圖中起橋梁作用的結(jié)點(diǎn)。這些節(jié)點(diǎn)可能作為MI中的潛在的致病基因。

圖1 數(shù)據(jù)分析流程圖

1.3 網(wǎng)絡(luò)模塊挖掘

對(duì)HPRD網(wǎng)絡(luò)與共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合構(gòu)建更為全面的lncRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，其中包括33個(gè)lncRNA，4522個(gè)mRNA，9134條邊。利用Cytoscape中的JActivemodule和Netmine插件進(jìn)行模塊挖掘。獲得5個(gè)功能性顯著模塊（module1-module5）。

1.4 Gene ontology(GO)分析

通過David在線平臺(tái)進(jìn)行對(duì)模塊中重要基因進(jìn)行功能注釋，篩選出具有診斷意義的基因。分析后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA在心肌梗死發(fā)病機(jī)制中扮演多重角色。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)lncRNAs、mRNAs

圖2 lncRNA 表達(dá)譜熱圖

圖3 mRNA 表達(dá)譜熱圖

對(duì)MI表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到的差異lncRNA與mRNA數(shù)量分別為86/9937個(gè) 。我們根據(jù)foldchange值進(jìn)行排序，提取了差異mRNA前0.5%的表達(dá)譜與差異lncRNA前5%的表達(dá)譜繪制熱圖，結(jié)果見圖2、3。樹狀圖表示對(duì)來自不同樣本的不同基因的聚類分析結(jié)果，從整體上來看疾病組與對(duì)照組在基因表達(dá)上有顯著差異。

2.2 miRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)模塊

對(duì)建立的疾病網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)證明顯現(xiàn)冪律分布[7],從網(wǎng)絡(luò)分析來看，網(wǎng)絡(luò)中結(jié)點(diǎn)度越大的點(diǎn)，表明可能會(huì)影響更多的鄰居結(jié)點(diǎn)，因此，這些點(diǎn)被考慮扮演hubs結(jié)點(diǎn)的角色。圖4顯示lncRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)結(jié)點(diǎn)的度分布是冪律分布。通過模塊挖掘來研究lncRNAs、mRNAs在癌癥當(dāng)中的共調(diào)控方式、以及基于局部策略來分析miRNAs的在心肌梗塞中的功能。

圖4 網(wǎng)絡(luò)度分布

根據(jù)得到的5個(gè)功能模塊當(dāng)中，大部分 lncRNAs具 有 較 大 的 度， 如：LINC00483、AL031598、AC009283、AC126365、H19、AP000654等，結(jié)果見表1。在各個(gè)模塊中有些結(jié)點(diǎn)的度較大，AP000654在模塊四、五的度數(shù)為：18、20。模塊一中度較大的節(jié)點(diǎn)GNAQ,它的度數(shù)為17，同時(shí)該基因已被研究證實(shí)參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡，并在損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的血管中參與反應(yīng)。研究表明有多個(gè)基因能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化,例如：lncRNA H19通過調(diào)節(jié)MAPK和NF-kB信號(hào)通路來促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[8]。動(dòng)脈粥樣硬化可能會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生心肌梗死。模塊二中度較大的節(jié)點(diǎn)IGF2R可能在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中發(fā)揮重要作用[9]。模塊四中的MMP1，MMP2，MMP7，MMP9，MMP12和MMP13 也被文獻(xiàn)證實(shí)在心肌梗死發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[10]。

表1 各模塊中邊、點(diǎn)數(shù)量和所含lncRNAs,mRNAs數(shù)量

在五個(gè)模塊中，對(duì)模塊進(jìn)一步分析，通過clusterone插件對(duì)模塊進(jìn)行挖掘，通過挖掘每個(gè)模塊中重要節(jié)點(diǎn)用紅色標(biāo)出，結(jié)果見圖5。這表明除了度大的點(diǎn)起到了HUB結(jié)點(diǎn)的作用，在網(wǎng)絡(luò)中還有一些結(jié)點(diǎn)度雖然小，在局部聯(lián)系較為緊密，成為一個(gè)團(tuán)隊(duì)發(fā)揮著作用,這些合作的結(jié)點(diǎn)可能在疾病發(fā)生過程中起到作用。在模塊二中TGFA、MAGI2、ADAM17聚在一個(gè)集合中，其中已被研究證實(shí)的增強(qiáng)ADAM17表達(dá)與大鼠急性心肌梗死后心肌重塑相關(guān)[11]。模塊四中ZC3H12A是位于人類一號(hào)染色體上的基因，已有文獻(xiàn)證實(shí)該基因與AHSP、HBA2存在互作關(guān)系?；騔C3H12A別名為MCPIP，近期研究發(fā)現(xiàn)MCPIP在缺血心肌組織中的表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)局部心肌炎癥來保護(hù)MI后的心臟重塑[12]。

圖5 lncRNAs-mRNAs功能顯著性模塊

2.3 模塊功能分析

根據(jù)得到的五個(gè)模塊的功能注釋結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)模塊中的多個(gè)基因都被注釋到血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生產(chǎn)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，結(jié)果見圖6。其中模塊三中的C3和C5被注釋到與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生產(chǎn)調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)。模塊一中的基因還被注釋到多對(duì)相反功能上，如：regulation of apoptotic process in bone marrow和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway，regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway。這表明其實(shí)組織中本身就存在平衡調(diào)控機(jī)制，若這些機(jī)制失衡也會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生。

3 結(jié)語

圖6 模塊功能注釋

為了探究心肌梗死中l(wèi)ncRNA與mRNA的調(diào)控機(jī)制，我們通過對(duì)心肌梗死芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，并且對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊挖掘獲得五個(gè)顯著性模塊，對(duì)模塊進(jìn)行分析LINC00483、AL031598、AC009283、AC126365、H19、AP000654在網(wǎng)絡(luò)中起到了HUB節(jié)點(diǎn)的作用，在網(wǎng)絡(luò)中還有一些結(jié)點(diǎn)度雖然小，但在局部聯(lián)系較為緊密，成為一個(gè)團(tuán)隊(duì)發(fā)揮著重要作用, 如：TGFA、MAGI2、ADAM17。其中regulation of apoptotic process in bone marrow和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway出現(xiàn)在多個(gè)模塊功能注釋中。通過本文的研究，發(fā)現(xiàn)lncRNA與mRNA協(xié)同作用，為研究者在lncRNAs、mRNAs和MI診斷方面的研究提供幫助。

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