劉影影，高 霞，李海斌，張光輝，吳 輝，張瑞芳，吳衛(wèi)東

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 河南省空氣污染健康效應(yīng)與干預(yù)國際聯(lián)合實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

近年來，在冬季中國頻發(fā)大面積的霧霾污染。顆粒物是我國一種重要的城市空氣污染物，顆粒物的大小、形態(tài)和組成與健康密切相關(guān)。粒徑大小不同的顆粒物，被吸入并沉積在呼吸系統(tǒng)的不同部位，對機體的危害也有差異。細顆粒物是指空氣動力學(xué)直徑≤2.5μm的顆粒物（PM2.5）。高濃度的PM2.5是霧霾的根本成因［1］。流行病學(xué)和實驗研究表明，暴露PM2.5與心、肺及腦血管疾病存在關(guān)聯(lián)［2］。當(dāng)PM2.5年均濃度達到35μg·m-3時，人群的死亡風(fēng)險比 10μg·m-3時約增加 15%［3-4］。但是，PM2.5與心肺疾病的關(guān)聯(lián)機制尚不清楚。研究證明，炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激在顆粒污染物誘發(fā)毒性效應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用［5］。盡管目前空氣質(zhì)量標(biāo)準是根據(jù)顆粒物的動力學(xué)直徑而制定的，但顆粒物大小并不是唯一的危害決定因素，在不同的觀測地點與季節(jié)可以觀察到顆粒物對人群健康的影響存在差異［6］，這可能與環(huán)境中顆粒物復(fù)雜的化學(xué)成分（如金屬、有機物等）、物理性質(zhì)（如大小、表面積等）以及宿主特異性狀（如已患疾病、基因的多態(tài)等）有關(guān)。顆粒污染物的排放源不同，其主要成分也隨之而異。深入了解顆粒物的來源、成分及其與毒性的內(nèi)在聯(lián)系有助于有效控制污染源顆粒物的排放［7］。有研究報道，西安市 PM2.5的化學(xué)組分有機碳、元素碳、氨離子、硝酸根離子、氯元素、金屬鎳等與人群總死亡率、呼吸系統(tǒng)疾病病死率呈正相關(guān)［8］。因此，深入了解大氣顆粒物化學(xué)組分對追蹤顆粒物來源以及闡明其對人體健康的影響有重要意義。本實驗以人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549為體外細胞模型，檢測新鄉(xiāng)市冬季大氣中PM2.5對A549細胞的損傷及炎性因子表達的誘導(dǎo)作用，為進一步闡明PM2.5誘導(dǎo)呼吸道炎癥的機制及制定霧霾防護措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器大流量采樣器、石英采樣膜（美國Tisch公司），超聲振蕩儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），真空冷凍干燥機（德國CHRIST公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國 Thermo Forma公司），倒置顯微鏡（廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司），酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司），超聲波清洗機、針頭過濾器（Millex FILTER 0.22μM）、離子色譜儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（inductive coupled plasma emission spectrometer，ICP-MS）（美國 Thermo Fisher公司），Ethos微波消解儀器（意大利 Milesone公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5二苯基四氮唑溴鹽［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、2.5 g·L-1EDTA-胰蛋白酶、HNO3、淋洗液（3.5 mmol·L-1Na2CO3和1.0 mmol·L-1NaHCO3）（美國 Sigma公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-8 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），洛斯維·帕克紀念研究所-1640培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute-1640，RPMI-1640）、胎牛血清（美國Gibco公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 空氣中 PM 2.5采集采樣地點位于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院院系樓7樓平臺，距地面約20 m。采樣時間為2016年1月份，采樣時避開雨雪天氣，采樣時間為早晨 8：00至次日早晨 8：00（24 h），連續(xù)采樣 24 h后更換新的采樣膜。采樣流量為40 NL·min-1，濾膜有效面積為193 mm×244 mm。采樣前與采樣后濾膜均置于干燥器中，室溫下平衡24 h，使用萬分之一電子天平快速稱量。采樣后將準確稱量的濾膜放入錫箔紙，再放入密封袋中，置于 -20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩？瞻诪V膜的處理方法與采樣濾膜相同，在檢測分析過程中作為空白對照使用。觀測期間PM2.5的質(zhì)量濃度值參照中國大氣質(zhì)量PM2.5濃度限值二級標(biāo)準（24 h平均質(zhì)量濃度不超過75μg·m-3）。

1.3.2 樣品前處理及水溶性陰離子測定將采樣濾膜和空白濾膜采用冷凍干燥法處理。將載有顆粒物的濾膜剪成1～2 cm寬的碎片，浸入15 mL雙蒸水中，在超聲振蕩器上振蕩3次，每次振蕩5 min，所得混合液采用多層無菌紗布過濾，收集洗脫液，置于真空冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥，取出收集干燥后的顆粒物，迅速置于-20℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆?。樣品使用前，用過濾的細胞培養(yǎng)液RPMI-1640加入濃縮顆粒物中，超聲震蕩混勻，制備成顆粒物懸液。另取收集好顆粒物的濾膜，浸泡到淋洗液中，用超聲波發(fā)生器間隔處理，每次 5 min，共處理 4次，總計20 min。使用標(biāo)準注射器經(jīng)0.22μm水相針頭過濾器濾去其中可能存在的不溶性大顆粒物質(zhì)，防止堵塞離子色譜儀進樣器，采用離子色譜儀檢測其PM2.5中可溶性陰離子成分，每個樣品平行測2次，取其平均值，得到新鄉(xiāng)市PM2.5中可溶性陰離子F-、Ac-、Cl-、NO2-、Br-、NO3-、SO42-、HPO4-的質(zhì)量濃度。

1.3.3 金屬元素測定檢測PM2.5中金屬元素質(zhì)量濃度的樣本與檢測PM2.5中陰離子質(zhì)量濃度的樣本相同，保證了實驗樣品的統(tǒng)一性。具體檢測方法如下：每個消解罐中分別加入7.00 mL HNO3、1 mL H2O2和1.0 mg顆粒物，密封后置于微波消解儀器中進行消解。微波消解程序為：700 W加熱3 min到180℃，1 000 W加熱3 min到190℃，1 000W加熱5 min到195℃，保持25 min，充分冷卻后卸壓，用超純水稀釋至8.00 mL。采用ICP-MS分析其中 Ca、Zn、Mg、Al、Cu、Mn、Se、Cr、Pb、Cd、Ni、As等元素的含量。

1.3.4 細胞培養(yǎng)及染毒將人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549置于細胞培養(yǎng)瓶中，采用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，細胞密度達約80%時加入1.5 mL 2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，離心收集細胞。加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液清洗細胞1次，再次離心后，使用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸并進行細胞計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為5×107L-1，然后將細胞接種于96孔板用于細胞活性檢測，接種于12孔板用于蛋白表達檢測。

1.3.5 人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549細胞活性檢測將人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549細胞懸液密度調(diào)整為5×107L-1，每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS清洗細胞2次，將細胞暴露于 0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 mg·L-1的PM2.5懸液中，每個濃度每孔加入PM2.5懸液100μL，每個染毒劑量設(shè)6個復(fù)孔。在96孔板周邊加入RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入5 g·L-1MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），輕微振蕩溶解結(jié)晶，自動酶標(biāo)儀于490 nm處測定吸光度值，計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率＝（1-染毒組吸光度／對照組吸光度）×100%。細胞生長抑制率越高，細胞活性越低。

1.3.6 人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549細胞培養(yǎng)液上清液中IL-8和IL-1β蛋白水平檢測將人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549細胞懸液濃度調(diào)整為5×107L-1，每孔1 mL接種于12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS清洗細胞2次，將細胞暴露至25.0、50.0、100.0 mg·L-1的顆粒物懸液中，置于37℃含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集上清液，置于1.5 mL離心管內(nèi)，1 500 r·min-1離心 5 min，采用雙抗體夾心ELISA法檢測上清液中IL-8和IL-1β蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用Graphpad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，各組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 新鄉(xiāng)市冬季大氣中PM 2.5水平新鄉(xiāng)市冬季大氣中PM2.5水平見表1。采樣期間，新鄉(xiāng)市大氣中PM2.5的質(zhì)量濃度在11～244μg·m-3。1月份大氣中PM2.5的24 h平均質(zhì)量濃度超過中國大氣質(zhì)量PM2.5濃度限值二級標(biāo)準的時間為18 d。

表1 新鄉(xiāng)市2016年1月份大氣中PM 2.5質(zhì)量濃度Tab.1 M ass concentration of PM 2.5 in Xinxiang city in January 2016

2.2 新鄉(xiāng)市PM 2.5中可溶性陰離子成分水平新鄉(xiāng)市中可溶性陰離子 F-、Ac-、Cl-Br-、NO3-、SO42-、HPO4-的質(zhì)量濃度分別為（0.426±0.031）、（2.348±0.337）、（4.693±0.479）、（0.088±0.010）、（0.052±0.004）、（24.350±1.832）、（18.563±1.761）、（0.086±0.013）μg·m-3，NO3-、SO42-為PM2.5的主要陰離子成分，NO3-／SO42-為1.311。

2.3 新鄉(xiāng)市PM 2.5中金屬元素水平結(jié)果見表2。PM2.5中不同金屬元素質(zhì)量濃度差別很大，Ca、Mg、Zn和Al質(zhì)量濃度較高，其中Ca元素平均質(zhì)量濃度 ＞1 000 ng·m-3，Ca／Al為 4.8。

表2 顆粒物中金屬元素平均質(zhì)量濃度Tab.2 Average mass concentration of metal elements in PM 2.5 （±s）

表2 顆粒物中金屬元素平均質(zhì)量濃度Tab.2 Average mass concentration of metal elements in PM 2.5 （±s）

元素 質(zhì)量濃度／（ng·m-3）元素 質(zhì)量濃度／（ng·m-3）Ca 2 248.74±141.31 Se 28.59±3.47 Zn 450.42±204.06 Cr 71.43±35.21 Mg 372.59±119.40 Pb 33.66±11.97 Al 468.20±46.36 Cd 1.29±0.42 Cu 17.16±2.41 Ni 9.11±4.22 Mn 20.52±5.32 As 3.47±0.18

2.4 PM 2.5對人Ⅱ型肺泡上皮細胞活性的影響結(jié)果見表 3。與 0.0 mg·L-1PM2.5組比較，12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 mg·L-1PM2.5組人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549生長抑制率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；200.0、400.0 mg·L-1PM2.5組人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549生長抑制率均顯著高于12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L-1PM2.5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L-1PM2.5組人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549生長抑制率兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；200.0 mg·L-1PM2.5組與400.0 mg·L-1PM2.5組人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549生長抑制率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 不同濃度PM 2.5對人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549生長抑制率的比較Tab.3 Comparison of inhibition ratio of PM 2.5 w ith different concentration on A549 of human typeⅡalveolar epithelial cell （n＝6，±s）

表3 不同濃度PM 2.5對人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549生長抑制率的比較Tab.3 Comparison of inhibition ratio of PM 2.5 w ith different concentration on A549 of human typeⅡalveolar epithelial cell （n＝6，±s）

注：與 0.0 mg·L-1 PM2.5組比較a P＜0.05；與 400 mg·L-1 PM2.5組比較b P＜0.05；與200 mg·L-1 PM2.5組比較c P＜0.05。

組別 生長抑制率／%0.0 mg·L-1 PM2.5組0.000±0.643 12.5 mg·L-1 PM2.5組 2.385±0.568abc 25.0 mg·L-1 PM2.5組 10.016±0.452abc 50.0 mg·L-1 PM2.5組 13.510±0.326abc 100.0 mg·L-1 PM2.5組 21.145±0.147abc 200.0 mg·L-1 PM2.5組 37.200±0.108ab 400.0 mg·L-1 PM2.5組 40.060±0.057a

2.5 不同濃度 PM 2.5對人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549培養(yǎng)液上清液中IL-1β和IL-8蛋白表達的影響結(jié)果見表4。與0.0 mg·L-1PM2.5組比較，25.0、50.0、100.0 mg·L-1PM2.5組人Ⅱ型肺泡上皮細胞培養(yǎng)液上清液中IL-1β和IL-8蛋白表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。25.0、50.0、100.0 mg·L-1PM2.5組人Ⅱ型肺泡上皮細胞培養(yǎng)液上清液中IL-1β和IL-8蛋白表達兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 不同PM 2.5濃度對人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549培養(yǎng)液上清液中IL-1β和IL-8蛋白表達的影響Tab.4 Effect of PM 2.5 on expression of IL-1βand IL-8 protein in A549 of human typeⅡalveolar epithelial cell culture supernatants （n＝6，±s）

表4 不同PM 2.5濃度對人Ⅱ型肺泡上皮細胞株A549培養(yǎng)液上清液中IL-1β和IL-8蛋白表達的影響Tab.4 Effect of PM 2.5 on expression of IL-1βand IL-8 protein in A549 of human typeⅡalveolar epithelial cell culture supernatants （n＝6，±s）

注：與0.0 mg·L-1 PM2.5組比較a P＜0.05。

組別 IL-1β／（ng·L-1） IL-8／（ng·L-1）0.0 mg·L-1 PM2.5組0.821±1.231 51.36±12.27 25.0 mg·L-1 PM2.5組 3.415±0.570a 738.40±99.76a 50.0 mg·L-1 PM2.5組 3.984±1.109a 858.60±37.66a 100.0 mg·L-1 PM2.5組 6.089±1.471a 969.20±51.12a F 3.69 66.10 P ＜0.05 ＜0.05

3 討論

本研究結(jié)果顯示，新鄉(xiāng)市冬季大氣中PM2.5質(zhì)量濃度在整個采樣期間均處于PM2.5污染較嚴重水平。從可溶性陰離子成分測定結(jié)果分析，新鄉(xiāng)市大氣氣溶膠的水溶性成分主要是NO3-和SO42-。一般認為，NO3-是機動車尾氣排放的二次轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。而SO42-則可能是燃煤排放到大氣中的SO2被氧化形成SO3，后者進而與大氣中的水形成硫酸，最后形成SO42-，導(dǎo)致大氣中 SO42-含量升高。采樣期間PM2.5中SO42-的質(zhì)量濃度為（18.563±1.761）μg·m-3，提示所收集的污染物中煤煙型硫氧化物較多。大氣顆粒物中NO3-與SO42-的質(zhì)量比（NO3-／SO42-）可以用來比較固定源（如燃煤）和移動源（如汽車尾氣）對大氣中硫和氮的貢獻量。如果大氣顆粒物中NO3-／SO42-較高，說明機動車對大氣中 PM2.5的貢獻要大于固定源；反之，若NO3-／SO42-較低，則說明SO2和NOx主要來自于煤的燃燒。具體而言，我國大部分地區(qū)燃煤排放的NOx是大氣中NOx的主要來源，NO3-／SO42-一般為0.3～0.5。新鄉(xiāng)市冬季霧霾組分含有大量NOx，而且NO3-／SO42-為1.311，比值較高，說明移動源（如汽車尾氣）對大氣中氮的貢獻量較大。

本研究還發(fā)現(xiàn)，新鄉(xiāng)市冬季PM2.5中不同金屬元素的質(zhì)量濃度差別很大，其中 Ca、Mg、Zn、Al質(zhì)量濃度較高。Ca是建筑揚塵的標(biāo)志性元素，Al是地殼源的代表性元素，Ca／Al可以識別建筑塵和土壤揚塵在氣溶膠中的貢獻［9］。河南省土壤背景的Ca／Al約為0.38，而新鄉(xiāng)市冬季 PM2.5中 Ca／Al達4.8，這表明新鄉(xiāng)市的建筑活動非?；钴S，建筑揚塵在PM2.5中的貢獻率非常大。一般認為，交通尾氣及揚塵污染源以其釋放的 Pb、Cu、Zn元素組合為特征［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，大氣中Pb、Cu、Zn 3種元素的質(zhì)量濃度均處于較高水平，說明交通尾氣及揚塵污染源可能是所收集空氣污染物的重要元素來源，此與陰離子分析的結(jié)果相一致。

IL-8為肺上皮細胞分泌的一種趨化因子，可募集炎性細胞進入肺組織。研究表明，IL-8水平與肺損傷的嚴重程度有關(guān)［11-12］，IL-8過表達是慢性肺炎癥性疾病的病理生理改變指標(biāo)［13-14］。炎癥機制由趨化因子調(diào)節(jié)，它通過與跨膜受體的相互作用控制各種類型的白細胞運輸。IL-8在炎癥過程中的主要作用是趨化靶細胞（特別是中性粒細胞）到炎癥部位［15-16］。IL-1β是一種重要的炎癥介質(zhì)［17-18］，能夠促使細胞間細胞黏附分子1的釋放，并能促進呼吸道內(nèi)嗜酸性粒細胞激活，促使其釋放炎性介質(zhì)，在氣道變應(yīng)性炎癥發(fā)生中發(fā)揮重要作用［19］。

暴露PM2.5對人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549的生長抑制率隨著PM2.5濃度加大而增高，表明高濃度的PM2.5具有較強的細胞毒性。本研究結(jié)果表明，暴露PM2.5可明顯增加人Ⅱ型肺泡上皮細胞內(nèi)炎性因子IL-1β和IL-8蛋白的表達，表現(xiàn)為隨著PM2.5染毒劑量的增加，IL-1β和IL-8蛋白表達水平隨之升高。IL-1β和IL-8在炎癥發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，在體外研究中常作為細胞炎性反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物。PM2.5暴露能明顯增加肺泡上皮細胞炎性因子IL-1β和IL-8蛋白的表達水平，這提示吸入高濃度的PM2.5可誘導(dǎo)呼吸道炎癥，也可能加重呼吸道炎性疾?。ㄈ缏宰枞头渭膊　⑾胺窝祝┗颊叩难仔园Y狀。新鄉(xiāng)市冬季PM2.5中的可溶性陰離子及金屬陽離子在PM2.5所致上述細胞損傷以及炎性效應(yīng)中的貢獻目前尚不清楚，有待進一步研究。

總之，新鄉(xiāng)市冬季PM2.5中的可溶性陰離子主要是NO3-和SO42-，且 NO3-／SO42-值較高，提示移動源（如汽車尾氣）對大氣PM2.5污染貢獻量較大；新鄉(xiāng)市冬季 PM2.5中 Ca、Mg、Zn、Al質(zhì)量濃度較高，說明交通尾氣及揚塵可能是新鄉(xiāng)市PM2.5的重要空氣污染源；暴露PM2.5可引起人Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷和細胞炎性反應(yīng)。

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