馬世江，尉 娜，韓艷艷，譚 軍

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003）

腦卒中是臨床上常見的腦血管疾病，致殘率極高，居人類病死原因的第2位［1］，其中缺血性腦卒中約占全部腦卒中的80%。缺血性腦卒中的治療目的主要是改善腦血流，減輕腦缺血后的神經(jīng)損害，提高腦細(xì)胞對缺血的耐受。腦血流的恢復(fù)不可避免地導(dǎo)致缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）［2］，缺血耐受是機(jī)體抵抗 IRI的一種生物現(xiàn)象。目前，通過藥物啟動和促進(jìn)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制而抑制IRI已成為國內(nèi)外研究的熱點。本研究選擇腺苷作為缺血預(yù)處理藥物，探討腺苷預(yù)處理對腦IRI大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）水平的影響，為臨床應(yīng)用腺苷預(yù)防和治療缺血性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Sprague Dawley大鼠60只，雌雄不限，出生24 h內(nèi)，體質(zhì)量10～12 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；腺苷注射液（沈陽光大制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030320）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Heraeu公司）；TD2-60B型低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 實驗方法參照文獻(xiàn)［3-4］進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒大鼠，放入超凈工作臺內(nèi)，用眼科剪在乳鼠后頸部做倒“T”型切口，挑起顱骨剪開，暴露雙側(cè)大腦半球，依據(jù)星形膠質(zhì)細(xì)胞在大腦皮層分布特點選取大鼠大腦皮質(zhì)，準(zhǔn)確剝離腦膜、血管膜，通過機(jī)械吹打法和差速貼壁法進(jìn)行處理，然后進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。對培養(yǎng)至第3代的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用免疫熒光法進(jìn)行膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鑒定。然后將第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代至96孔板內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁并伸出突觸后，隨機(jī)分為正常對照組、氧糖剝奪組和腺苷預(yù)處理組。正常對照組細(xì)胞不進(jìn)行氧糖剝奪，在氧糖剝奪期及復(fù)氧糖期均更換高糖DMEM。氧糖剝奪組細(xì)胞在氧糖剝奪期更換為無糖、無血清的DMEM；腺苷預(yù)處理組細(xì)胞在氧糖剝奪前24 h給予含100μmol·L-1腺苷的高糖DMEM培養(yǎng)，氧糖剝奪期將培養(yǎng)基更換為無糖、無血清DMEM。氧糖剝奪期，將氧糖剝奪組和腺苷預(yù)處理組細(xì)胞放入含體積分?jǐn)?shù)95%氮氣、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的自制缺氧倉內(nèi)缺氧8 h；在復(fù)氧糖期，氧糖剝奪組及腺苷預(yù)處理組細(xì)胞培養(yǎng)基更換為預(yù)熱的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM，隨即轉(zhuǎn)移至37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。正常對照組在37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

1.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察用德國Leica光學(xué)顯微鏡觀察3組星形膠質(zhì)細(xì)胞在復(fù)氧糖24 h后的形態(tài)變化。

1.5 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，M TT）法檢測各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力取各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×108L-1密度接種于96孔板，每孔加入MTT 50μL，混合均勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，然后1 000 r·min-1離心5min，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO），搖晃 10 min，在 37℃條件下，450 nm波長處測細(xì)胞吸光度值，每組設(shè)5個復(fù)孔，重復(fù)測定3次，吸光度值越高代表細(xì)胞活力越高。

1.6 ELISA法測各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF和Ang-1水平取各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞以密度為5×107L-1接種于24孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF和Ang-1水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較均采用Tukey法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化復(fù)氧糖24 h后，正常對照組星形膠質(zhì)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，大量的突觸在相連的細(xì)胞之間形成（圖1A）；氧糖剝奪組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體變圓，水腫明顯，細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則形變成梭形，突起明顯變短甚至消失（圖1B）；腺苷預(yù)處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫較氧糖剝奪組輕，細(xì)胞排列相對整齊（圖1C）。

圖1 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)（×400）Fig.1 M orphology of astrocyte in each group（×400）

2.2 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活力比較正常對照組、氧糖剝奪組和腺苷預(yù)處理組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活力分別為 0.698±0.059、0.196±0.062、0.412±0.009。氧糖剝奪組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活力低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝3.561，P＜0.05）；腺苷預(yù)處理組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活力高于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝2.102，P＜0.05）。

2.3 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平比較正常對照組、氧糖剝奪組、腺苷預(yù)處理組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平分別為（0.038±0.005）、（0.053±0.007）、（0.084±0.006）μg·L-1；氧糖剝奪組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝1.394，P＜0.05）；腺苷預(yù)處理組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF水平顯著高于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝1.584，P＜0.05）。

2.4 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平比較正常對照組、氧糖剝奪組、腺苷預(yù)處理組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平分別為（0.030±0.007）、（0.049±0.008）、（0.080±0.004）μg·L-1。氧糖剝奪組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝1.633，P＜0.05）；腺苷預(yù)處理組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中Ang-1水平顯著高于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝1.632，P＜0.05）。

3 討論

機(jī)體的自我保護(hù)作用在腦缺血發(fā)生后會產(chǎn)生代償，缺血區(qū)血流改善有利于減輕缺血性腦梗死的損害［5］。在缺血性腦卒中的病理生理過程中，缺血區(qū)中心部位的腦細(xì)胞在一定時間內(nèi)會發(fā)生不可逆損傷，血流恢復(fù)是改善缺血損傷的關(guān)鍵。IRI的提出受到醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注，腦缺血后會出現(xiàn)缺氧、自由基和興奮性氨基酸增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等病理生理變化。研究顯示，谷氨酸的興奮性毒性是腦IRI的重要機(jī)制之一［6］。因此，降低谷氨酸水平，也是減輕腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷的重要策略。

腺苷作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑，可與G蛋白耦聯(lián)受體相結(jié)合，激活三磷腺苷依賴的鉀離子通道，阻止興奮性氨基酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元除極效應(yīng)，抑制興奮性氨基酸釋放，降低細(xì)胞膜對Ca2+的通透性，擴(kuò)張血管，抑制炎性細(xì)胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集，減輕炎性細(xì)胞、自由基導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷［7-8］。腺苷在臨床中較常用，也是腦缺血疾病相關(guān)基礎(chǔ)研究的熱點，具有效果好、價格便宜等優(yōu)點［9］。本實驗選擇腺苷進(jìn)行缺血預(yù)處理，通過對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞活力檢測發(fā)現(xiàn)，腺苷預(yù)處理組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活力顯著高于氧糖剝奪組，表明腺苷預(yù)處理可以對細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，改善IRI。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要支持成分，具有聯(lián)系神經(jīng)元、調(diào)節(jié)神經(jīng)元代謝、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、組成血-腦屏障及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)，在腦梗死大鼠模型中，梗死灶周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活［11］，說明激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元損傷修復(fù)過程中起到了關(guān)鍵作用。研究表明，血管再通與神經(jīng)元的增殖密切相關(guān)［12］。腦IRI后，血管再生可以提高損傷神經(jīng)元的恢復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，改善后遺癥。生長因子、神經(jīng)干細(xì)胞、黏附因子等可以促進(jìn)血管生成，VEGF和Ang-1最具代表性。VEGF和Ang-1是一類促進(jìn)血管形成和分化的重要調(diào)節(jié)因子，與血管的生成關(guān)系密切［13-15］。研究表明，腦缺血會誘導(dǎo)VEGF和Ang-1的生成，從而改善缺血邊緣區(qū)域的血供和恢復(fù)缺血腦組織的功能［16］。唐清等［17］研究顯示，VEGF具有神經(jīng)保護(hù)作用。SUN等［18］對大腦中動脈阻塞模型大鼠腦內(nèi)注射外源性VEGF，結(jié)果顯示，VEGF組新生血管密度較正常組高2倍，較缺血對照組高4倍。而且血清中VEGF水平的升高還可以改善缺血性腦血管病患者的認(rèn)知功能［19］。Ang-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶Tie-2的配體，通過Tie-2的磷酸化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽、遷移，穩(wěn)定血管，促進(jìn)血管生長。VEGF與Ang-1關(guān)系密切，VEGF促進(jìn)早期血管形成，形成原始血管網(wǎng)，Ang-1則在隨后的血管重建中發(fā)揮作用，促進(jìn)成熟的血管網(wǎng)形成。Ang-1還能夠抵抗VEGF以及炎癥引起的血管滲漏，是一種能夠抵抗血管滲漏的內(nèi)源性蛋白質(zhì)因子，它能促進(jìn)和互補(bǔ)VEGF促血管新生的功能［20］。莊越等［21］研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1可能通過減輕腦血管炎性反應(yīng)和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性來減輕腦血管內(nèi)皮細(xì)胞IRI，從而起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞通過氧糖剝奪，可以刺激Ang-1表達(dá)增加；通過腺苷預(yù)處理可以進(jìn)一步增加Ang-1表達(dá)，抑制IRI。

綜上所述，腺苷預(yù)處理可以使氧糖剝奪后的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞活力增加；表明腺苷預(yù)處理可能是通過上調(diào)VEGF和Ang-1的表達(dá)來減輕大腦損傷，從而產(chǎn)生腦保護(hù)作用。本研究為缺血性腦卒中的臨床治療提供了新的思路。

［1］劉亞美，李彤.豫北地區(qū)青年缺血性腦卒中危險因素分析［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2017，34（4）：323-326.

［2］LIN C，WANG N.Rhokinases and ischemic cerebrovascular diseases［J］.Am JPathol，2014，8（1）：3-5.

［3］黃素素，張云云，孫波，等.大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪后slit2，robo1的表達(dá)研究［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29（1）：4-8.

［4］邢東，董輝，朱明霞.體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪后DDRl的表達(dá)情況［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43（2）：133-136.

［5］WINSHIP IR.Cerebral collateralsand collateral therapeutics for acute ischemic stroke［J］.Microcirculation，2015，22（3）：228.

［6］魏秀娥，榮良群，張清秀，等.Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬谷氨酸受體表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2013，22（9）：776-779.

［7］ASGHARI A A，AZARNIA M，MIRNAJAFI-ZADEH J，et al.A-denosine A1 receptor agonist，N6-cyclohexy ladenosine，protects myelin and induces remyelination；electrophy siologicaland histopathological studies［J］.JNeurol Sci，2013，325（1／2）：22-28.

［8］李勇，閔穎君，郎莉莉，等.局部應(yīng)用腺苷 A2a受體拮抗劑對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜谷氨酰胺合成酶（GS）和L-谷氨酸-L-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLAST）表達(dá)的影響［J］.眼科新進(jìn)展，2017，37（7）：615-618.

［9］李楊.腺苷及其受體對缺血性腦損傷的影響［J］.醫(yī)學(xué)信息，2014，10（12）：14-16.

［10］范蒙蒙，王曉莉，劉長云，等.臍血單個核細(xì)胞移植對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響及其與骨形成蛋白4的相關(guān)性研究［J］.中華實用兒科臨床雜志，2014，29（13）：1029-1032.

［11］BECK JV，CHART P，BEMAUDIN M，et al.Glial responses，clusterin and complement in permanent focal cerebral ischemia in themouse［J］.Glia，2002，31（1）：39-50.

［12］CHOPPM，LI Y，ZHANG J.Plasticity and remodeling of brain［J］.JNeurol Sci，2008，265（1／2）：97-101.

［13］王群，姜嚴(yán)明，趙杰，等.血管內(nèi)皮生長因子靶向抗體對大鼠角膜堿燒傷后新生血管抑制作用的研究［J］.眼科新進(jìn)展，2017，37（11）：1010-1014.

［14］呂亞男，宮媛媛.抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）治療與視網(wǎng)膜下纖維化研究進(jìn)展［J］.眼科新進(jìn)展，2017，37（6）：583-586.

［15］張翀，陳蕾，李婷婷.血管生成素-1對小鼠視網(wǎng)膜新生血管和血管內(nèi)皮生長因子的抑制作用［J］.眼科新進(jìn)展，2015，35（1）：31-34.

［16］RUAN L，WANG B，ZHUGE Q，et al.Coupling of neurogenesis and angiogenesis after ischemie strokeI［J］.Brain Res，2015，16（23）：166-173.

［17］唐清，湯繼宏.血管內(nèi)皮生長因子對癲癇發(fā)作的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中華實用兒科臨床雜志，2015，30（12）：958-960.

［18］SUN Y，JIN K，XIE L，et al.VEGF-induced neuroprotection，neurogenesis，and angiogenesis after fecal cerebral ischemia［J］.J Clin Invest，2003，111（12）：1843-1851.

［19］莊獻(xiàn)博，徐光軍，王未飛，等.腦梗死患者血清抗心磷脂抗體和血管內(nèi)皮生長因子水平與卒中后認(rèn)知障礙的關(guān)系［J］.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2015，24（2）：152-154.

［20］PASSOS-SILVA D G，VERANO-BRAGA T，SANTOS R A.Angiotensin（1-7）：beyond the cardio-renal actions［J］.Clin Sci（Lond），2013，124（7）：443-456.

［21］莊越，金文香.血管生成素1對腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用及其機(jī)制［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2014，40（5）：305-308.