邵秋靜，趙利芹，李 晏，谷景陽(yáng)，劉 聰，王長(zhǎng)虹

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院精神科，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001）

抑郁癥是一種慢性、易復(fù)發(fā)的常見(jiàn)精神疾病，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無(wú)一種假說(shuō)能夠全面地解釋病因，臨床治療的發(fā)展也受到阻礙［1］。隨著抑郁癥分子病理學(xué)研究的發(fā)展，近年來(lái)，有關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路的研究受到了人們的廣泛關(guān)注［2］。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1）主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，參與抑郁和神經(jīng)炎癥等的調(diào)節(jié)［3］，其主要作用是介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）去磷酸化，MAPK是真核生物中一類(lèi)高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，包括3個(gè)亞族：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、應(yīng)激活化蛋白激酶和 p38［4］。MAPK可調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)不同基因的轉(zhuǎn)錄，其活性受蛋白激酶的磷酸化及去磷酸化調(diào)節(jié)，是一個(gè)重要的細(xì)胞信號(hào)通路［3］。目前，抑郁癥的炎性假說(shuō)越來(lái)越受到人們重視，而MAPK的3個(gè)亞族中p38與炎癥較為密切［5］。本研究以慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激（chronic unpredictablemild stress，CUMS）制備抑郁癥大鼠模型，以氟西汀為干預(yù)藥物，探討氟西汀對(duì)抑郁癥大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及海馬內(nèi)MKP-1、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）和p38表達(dá)的影響，以期為抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)特定病原體級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，質(zhì)量合格證號(hào)：11400700139232。大鼠飼養(yǎng)于濕度40%～50%、溫度（24.0±1.0）℃的獨(dú)立通氣籠系統(tǒng)，晝夜比為12 h／12 h。

1.2 藥物、試劑與儀器鹽酸氟西?。ǘY來(lái)蘇州制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J 20130010），MKP-1抗體（英國(guó)Abcam公司），p38蛋白（p38 MAPK）抗體、pp38（p-p38 MAPK）抗體（美國(guó)CST公司），磷酸甘油醛脫氫酶 （glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、羊抗兔二抗和小鼠抗兔二抗（中衫金橋生物技術(shù)有限公司）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodi-um dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）儀和轉(zhuǎn)移裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、抑郁癥組、生理鹽水組和氟西汀組，每組10只。

1.3.2 抑郁癥大鼠模型制備抑郁癥組、生理鹽水組和氟西汀組大鼠均孤養(yǎng)，并給予8周CUMS，制備抑郁癥模型；正常組大鼠以每籠3只正常環(huán)境飼養(yǎng)8周，不給予CUMS。抑郁癥造模方法參照LIU等［6］的方法，CUMS包括：潮濕墊料24 h、禁食24 h、禁水24 h、晝夜顛倒24 h、夾尾（夾大鼠尾部近體端1／3處，每次1 min，）、電擊足底（電壓 60 V，每次10 s，每次間隔5 s）、強(qiáng)迫游泳（水溫4℃，每次5 min）、行為限制（每次2 h）、夜間籠子傾斜45°，上述9種刺激隨機(jī)排列，相同刺激不可連續(xù)出現(xiàn)，連續(xù)8周。

1.3.3 干預(yù)方法于CUMS第5～8周，氟西汀組大鼠給予氟西汀灌胃（10 mg·kg-1·d-1）［7］，生理鹽水組大鼠給予同體積的生理鹽水灌胃（10 mg·kg-1·d-1）。正常組和抑郁癥組大鼠不給予任何干預(yù)。

1.3.4 大鼠行為學(xué)評(píng)估分別于造模前、造模后（CUMS 4周后）及干預(yù)后對(duì)4組大鼠進(jìn)行體質(zhì)量稱量、蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠行為學(xué)。（1）蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)［8-9］：將大鼠置于安靜的房間；第1天，在籠子上放置2瓶10 g·L-1蔗糖溶液；第2天，1瓶10 g·L-1蔗糖溶液，1瓶清水；第3天，大鼠禁食禁水；第 4天，定量好 1瓶10 g·L-1蔗糖水，1瓶清水，12 h后將糖水瓶與清水瓶交換位置，測(cè)試24 h，稱量。計(jì)算蔗糖偏好指數(shù)。蔗糖偏好指數(shù)＝糖水消耗量／（清水和糖水消耗量）×100%。（2）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)［10］：曠場(chǎng)由不透明鋼板制成（100 cm×100 cm×40 cm），置于暗室，將大鼠置于曠場(chǎng)中心，攝像機(jī)拍攝，Smart virsion2.5軟件（上海欣軟信息科技有限公司）記錄大鼠5 min內(nèi)行為，計(jì)算大鼠運(yùn)動(dòng)總路程，并人工同步記錄大鼠直立次數(shù)。（3）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：參考 PORSOLT等［11］的方法稍作修改，水溫約25℃，測(cè)試6 min，記錄后5 min的不動(dòng)時(shí)間。

1.3.5 W estern blot法測(cè)定大鼠海馬組織內(nèi)M KP-1、p-p38和p38蛋白表達(dá)4組大鼠最后一次行為評(píng)估后，給予 100 g·L-1水合氯醛（4 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，在冰上迅速鈍性分離出雙側(cè)海馬組織，用生理鹽水沖洗后放入冷存管（-80℃），置入液氮備用。取適量海馬組織放入2 mL離心管中，加入放射免疫沉淀裂解液和磷酸酶抑制劑的混合物，最后加入研磨珠，使用組織研磨儀研磨約60 s，在冰上裂解30 min，放入離心機(jī)，4℃下13 000×g離心15 min，置于-80℃冰箱備用。采用二喹啉甲酸法檢測(cè)海馬組織總蛋白濃度；進(jìn)行SDS-PAGE：90 V電泳30 min、160 V電泳50 min；轉(zhuǎn)膜：300 mA轉(zhuǎn)膜90 min；使用Tris洗膜緩沖液洗膜2 min；封閉：50 g·L-1牛血清白蛋白封閉室溫?fù)u床1 h；用Tris洗膜緩沖液洗膜3次，每次8 min；一抗孵育：加入一抗，室溫?fù)u床1 h，4℃過(guò)夜；用Tris洗膜緩沖液洗膜3次，每次8 min；孵育二抗：室溫孵育2 h；用Tris洗膜緩沖液洗膜3次，每次8 min。滴加超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液至聚偏氟乙烯膜上，顯影拍照、保存條帶圖片。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像分析儀自帶分析軟件對(duì)目的蛋白、管家基因蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較方差齊時(shí)采用最小顯著性差異法，方差不齊時(shí)采用Tamhane法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較結(jié)果見(jiàn)表1。造模前4組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與造模前比較，造模后抑郁癥組、生理鹽水組和氟西汀組大鼠蔗糖偏好指數(shù)降低，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)減少，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造模后抑郁癥組、生理鹽水組和氟西汀組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，造模后抑郁癥組、生理鹽水組和氟西汀組大鼠蔗糖偏好指數(shù)降低，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)減少，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，干預(yù)后抑郁癥組和生理鹽水組大鼠蔗糖偏好指數(shù)降低，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)減少，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與抑郁癥組和生理鹽水組比較，干預(yù)后氟西汀組大鼠蔗糖偏好指數(shù)升高，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離和直立次數(shù)增加，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 4組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of the behavioral indexes of rats in the four groups （±s）

表1 4組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of the behavioral indexes of rats in the four groups （±s）

注：與正常組比較a P＜0.05；與造模前比較b P＜0.05；與抑郁癥組和生理鹽水組比較c P＜0.05。

組別 n／s正常組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離／m 直立次數(shù) 蔗糖偏好指數(shù)／% 強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間10造模前 157.95±24.73 28.50±5.64 68.48±10.72 15.40±5.75造模后 159.48±41.47 26.10±5.73 71.80±14.10 29.00±19.97干預(yù)后 149.21±21.56 24.70±7.41 69.40±8.98 39.50±24.69抑郁癥組 10造模前 162.20±16.36 27.00±9.27 68.29±9.09 16.30±5.05造模后 109.57±33.61ab 7.20±3.59ab 56.00±10.23ab 71.40±29.92ab干預(yù)后 98.45±16.33a 6.70±3.40a 44.00±11.51a 91.40±17.59a生理鹽水組 10造模前 155.89±26.74 30.70±6.58 63.36±12.18 14.70±4.19造模后 106.52±14.74ab 6.20±1.54ab 54.20±15.99ab 72.00±19.57ab干預(yù)后 97.15±18.39a 5.70±4.22a 40.10±11.78a 96.90±18.78a氟西汀組 10造模前 152.91±31.34 28.60±7.85 64.40±9.38 16.50±5.25造模后 111.31±16.25ab 7.20±2.42ab 49.90±15.63ab 88.10±35.04ab干預(yù)后 118.37±22.37c 15.20±5.73c 63.50±12.16c 59.10±26.24c

2.2 4組大鼠海馬組織中 MKP-1、p-p38、p38蛋白表達(dá)及p-p38／p38比較結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2和表2。抑郁癥組和生理鹽水組大鼠海馬組織中MKP-1表達(dá)顯著高于正常組（P＜0.05），氟西汀組大鼠海馬組織中MKP-1表達(dá)顯著低于抑郁癥組和生理鹽水組（P＜0.05），抑郁癥組與生理鹽水組大鼠海馬組織中MKP-1表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），氟西汀組與正常組大鼠海馬組織中MKP-1表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4組大鼠海馬組織中p-p38、p38蛋白表達(dá)及p-p38／p38比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 4組大鼠海馬組織中M KP-1蛋白表達(dá)（W estern blot）Fig.1 Expression of MKP-1 protein in the hippocampus tissues of rats in the four groups（Western blot）

圖2 4組大鼠海馬組織中p-p38和p38蛋白表達(dá)（W estern blot）Fig.2 Expression of p-p38 and p38 protein in the hippocampus tissues of rats in the four groups（W estern blot）

表2 4組大鼠海馬組織中MKP-1、p-p38、p38蛋白表達(dá)及p-p38／p38比較Tab.2 Com parison of the expression of MKP-1，p-p38，p38 protein and p-p38／p38 in the hippocampus tissues of rats in the four groups （±s）

表2 4組大鼠海馬組織中MKP-1、p-p38、p38蛋白表達(dá)及p-p38／p38比較Tab.2 Com parison of the expression of MKP-1，p-p38，p38 protein and p-p38／p38 in the hippocampus tissues of rats in the four groups （±s）

注：與正常組比較a P＜0.05；與抑郁癥組和生理鹽水組比較b P＜0.05。

組別 n MKP-1 p-p38 p38 p-p38／p38正常組10 0.85±0.66 0.74±0.01 1.08±0.03 0.69±0.02抑郁癥組 10 1.88±0.76a 0.73±0.04 1.09±0.03 0.68±0.02生理鹽水組 10 1.74±0.73a 0.76±0.03 1.09±0.01 0.71±0.03氟西汀組 10 0.99±0.56b 0.74±0.04 1.10±0.04 0.68±0.03

3 討論

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的減少、HPA軸功能失調(diào)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌失調(diào)、炎癥反應(yīng)系統(tǒng)紊亂等因素有關(guān)，目前，抑郁癥的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確［1，6］。

CUMS模型是目前最常用的抑郁模型，被廣泛應(yīng)用于抑郁癥病理機(jī)制與藥物治療學(xué)研究［12］。本研究采用CUMS制備大鼠抑郁癥模型，經(jīng)過(guò)4周的CUMS，大鼠表現(xiàn)出蔗糖偏好指數(shù)降低，運(yùn)動(dòng)能力下降，表明成功建立了抑郁模型。這與國(guó)內(nèi)外學(xué)者［7，13-14］的研究結(jié)果一致。

有研究表明，MKP-1抑制劑血根堿和氟西汀均可使抑郁癥大鼠出現(xiàn)強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著減少，海馬組織中 MKP-1表達(dá)降低［15］。DURIC等［16］研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者尸體海馬組織中MKP-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。研究顯示，氟西汀可改善CUMS誘導(dǎo)的大鼠快感缺乏和無(wú)助行為，并部分逆轉(zhuǎn)MKP-1表達(dá)上調(diào)；在正常大鼠海馬中靶向注入MKP-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，大鼠可出現(xiàn)抑郁樣行為；而MKP-1基因敲除的小鼠給予CUMS造模，并未出現(xiàn)抑郁樣癥狀［16］。本研究結(jié)果顯示，抑郁癥組和生理鹽水組大鼠海馬組織中MKP-1表達(dá)顯著高于正常組，氟西汀組大鼠海馬組織中MKP-1表達(dá)顯著低于抑郁癥組和生理鹽水組，抑郁癥組與生理鹽水組大鼠海馬組織中MKP-1表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究結(jié)果一致［17-18］。據(jù)此推測(cè)，MKP-1在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中起重要作用，有望成為抑郁癥治療的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)；氟西汀可以逆轉(zhuǎn)CUMS所致抑郁癥大鼠海馬組織內(nèi)MKP-1高表達(dá)，MKP-1可能參與了氟西汀治療抑郁癥的作用機(jī)制。

抑郁癥的炎性假說(shuō)越來(lái)越受到重視，所以設(shè)想p38通路是否通過(guò)炎性反應(yīng)與抑郁癥有關(guān)聯(lián)。p38通路與炎癥反應(yīng)聯(lián)系密切，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病等被證實(shí)部分由p38途徑調(diào)節(jié)［19-21］。本研究結(jié)果顯示，4組大鼠海馬組織中p-p38、p38蛋白表達(dá)及p-p38／p38比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；推測(cè)p38信號(hào)通路與CUMS所致抑郁癥大鼠無(wú)關(guān)，氟西汀對(duì)CUMS所致抑郁癥大鼠海馬組織中p38信號(hào)通路無(wú)影響。這與BUDZISZEWSKA等［22］研究結(jié)果一致。

綜上所述，CUMS可成功誘導(dǎo)大鼠抑郁癥，MKP-1可能與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，MKP-1在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中可能不是通過(guò)p38信號(hào)通路起作用；氟西汀可能是通過(guò)下調(diào)海馬組織中MKP-1表達(dá)而發(fā)揮治療抑郁癥的作用。

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