周馨 馬筱玲 葉書(shū)來(lái) 魯懷偉 王影

(中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230001)

尖端賽多孢子菌 (Scedosporiumapiospermum)以前被稱為尖端單孢子菌，普遍存在于自然界，其有性生活階段是波氏假阿利什霉 (Pseudallescheriaboydii)[1]。尖端賽多孢子菌是條件致病真菌之一，偶可導(dǎo)致無(wú)癥狀真菌定植或局部感染, 在免疫力低下者可發(fā)生播散性或系統(tǒng)性真菌感染?，F(xiàn)將我院收治的1例尖端賽多孢子菌感染患者的臨床癥狀、致病菌的鑒定和抗真菌藥體外敏感試驗(yàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

患者女，51歲，因發(fā)現(xiàn)肺部及顱內(nèi)占位，且合并干燥綜合癥，于2017年10月12號(hào)入院。患者無(wú)明顯誘因出現(xiàn)右側(cè)肢體無(wú)力、麻木，伴有體溫升高，最高達(dá)39℃，白細(xì)胞11.26×109/L，葡聚糖15.82 pg/mL，CRP 58.9 mL/L。入呼吸科，頭顱胸部CT提示：①左頂葉占位；②兩肺多發(fā)結(jié)節(jié) (見(jiàn)圖1)。進(jìn)一步治療轉(zhuǎn)入腦外科，積極完善相關(guān)檢查。除手術(shù)禁忌癥，在全身麻醉下行左顳頂開(kāi)顱顱內(nèi)病灶切除。腦部引流物做病理組織學(xué)檢查，細(xì)菌培養(yǎng)和鏡檢涂片。病理組織學(xué)顯示：左顳頂肉芽腫性炎，內(nèi)見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，伴少量淋巴細(xì)胞，多核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見(jiàn)真菌菌絲和孢子，見(jiàn)圖2箭頭所示。術(shù)后以抗感染，支持治療，后突發(fā)昏迷，CT提示肺部大片炎癥，顱內(nèi)病變術(shù)后，轉(zhuǎn)入ICU。在ICU給予抗真菌藥，以伏立康唑?yàn)橹?，甘露醇脫水降低顱內(nèi)壓，預(yù)防癲癇，針對(duì)干燥綜合癥請(qǐng)風(fēng)濕免疫科會(huì)診予以激素及免疫抑制劑等治療，維持循環(huán)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)支持，糾正電解質(zhì)紊亂等對(duì)癥治療處理。動(dòng)態(tài)復(fù)查肺部CT呈逐漸好轉(zhuǎn)，顱內(nèi)水腫逐漸減輕。一度體溫趨于正常，肺部感染改善，腦部腫脹消退，生命體征基本穩(wěn)定。但患者最后因蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致死亡。

1.2 形態(tài)學(xué)檢查

直接鏡檢 將顱內(nèi)病灶部分膿性引流物標(biāo)本直接鏡檢涂片，并接種沙氏培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)平板和血培養(yǎng)皿，35℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)第5天和第10天觀察菌落及單個(gè)菌落形態(tài)。取部分培養(yǎng)真菌壓片，在顯微鏡下觀察真菌形態(tài)特征。

真菌熒光鏡檢 挑取樣本制成涂片干燥后固定，用熒光染料染色。先加一滴A液覆蓋于標(biāo)本，然后直接在標(biāo)本上加一滴B液，蓋上蓋玻片，染色2分鐘，于熒光顯微鏡 (波長(zhǎng)340～380 nm)下觀察形態(tài)。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

采用石碳酸法[2]提取真菌DNA。采用真菌通用引物ITS1 (tccgtaggtgaacctgcgg)和ITS4 (tcctccgcttattgatatgc)，rDNAITS區(qū)域的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定。反應(yīng)條件：94℃ 85 s，95℃ 35 s，55℃ 55 s，72℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濃縮，純化后用DNA測(cè)序儀測(cè)序。序列結(jié)果在基因庫(kù)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ncbi.nlm.nih/blast)中進(jìn)行同源性序列搜索。

1.4 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)CLSIMP-38A方案[3]，E-test真菌藥敏試驗(yàn)，將產(chǎn)孢豐富的真菌用生理鹽水制成標(biāo)準(zhǔn)的0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊恼婢咦討乙?，密涂于RPMI 1640培養(yǎng)基，35℃孵育48 h后讀取結(jié)果，判讀兩性霉素B、氟康唑和伏立康唑藥敏結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 真菌學(xué)檢查

顱內(nèi)膿性引流物標(biāo)本直接鏡檢涂片，見(jiàn)圖3，可見(jiàn)大量菌絲和孢子，由于分泌物雜質(zhì)太多，菌絲和孢子鏡檢不是很清晰，不能明確判斷。將分泌物在血平板培養(yǎng)，真菌培養(yǎng)板和沙保羅培養(yǎng)5 d后，單個(gè)菌落為白色棉花狀小菌落，10 d后菌落顏色開(kāi)始變深，菌落變大，如羊毛樣，有褶皺感，見(jiàn)圖4。取部分菌落組織制片，在顯微鏡可清晰見(jiàn)到有隔菌絲、較粗；分生孢子梗側(cè)生或頂生，梗端著生單個(gè)分生孢子，分生孢子橢圓形，環(huán)痕產(chǎn)孢，有時(shí)可產(chǎn)生多個(gè)孢子，見(jiàn)圖5。熒光顯色更加清晰，見(jiàn)圖6，低倍鏡真菌熒光染色顯示大量真菌的菌絲及孢子均呈亮藍(lán)色，其他細(xì)菌和組織呈弱藍(lán)色熒光，背景為藍(lán)黑色。高倍鏡下較粗的菌絲和大量孢子發(fā)出亮藍(lán)色熒光，孢子著生于菌絲頂端，橢圓形。通過(guò)形態(tài)學(xué)初步鑒定為尖端賽多孢子菌。

2.2 rDNA序列分析

rDNA ITS間區(qū)序列在基因庫(kù)核酸序列同源性搜索，結(jié)果與基因庫(kù)編號(hào)為菌株UASWS1162相比，其基因序列同源性為99%，證明此臨床菌株為尖端賽多孢子菌。ITS間區(qū)568 bp?；驇?kù)注冊(cè)號(hào)分別為:gi748806742，KM279976。

2.3 藥敏結(jié)果

三種藥敏結(jié)果顯示為兩性霉素B>32 μg/mL、氟康唑>32 μg/mL和伏立康唑0.064 μg/mL。

3 討 論

尖端賽多孢子菌普遍存在于自然界中，如土壤、污水、腐物等，在惡性腫瘤、器官移植、長(zhǎng)期應(yīng)用激素或免疫抑制劑等免疫力低下患者可引起嚴(yán)重感染或感染擴(kuò)散[4]。近年研究發(fā)現(xiàn), 尖端賽多孢子菌引起的感染大部分為深部感染。該患者自身合并干燥綜合癥，曾使用大量免疫抑制劑，造成免疫低下，且伴有肺部嚴(yán)重的感染。有文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，腦部易發(fā)生尖端賽多孢子菌感染，并導(dǎo)致顱內(nèi)膿腫形成，這與該患者腦部較大占位性病變一致。

按照感染病研究院真菌病研究組 (EORTC/MSG)的標(biāo)準(zhǔn)，診斷尖端賽多孢子菌感染，需從感染部位取標(biāo)本，通過(guò)組織學(xué)和 (或)細(xì)胞學(xué)證實(shí)，并從其霉樣培養(yǎng)物中分離出該菌[8]。該患者通過(guò)影像學(xué)報(bào)告顯示腦部占位病變，因此行左顳頂開(kāi)顱顱內(nèi)病灶切除，取腦部組織做病理組織學(xué)檢查和腦部引流物做細(xì)菌培養(yǎng)，病理組織結(jié)果證實(shí)腦部組織有菌絲和孢子浸潤(rùn)。尖端賽多孢子菌有特異的形態(tài)，通過(guò)對(duì)純培養(yǎng)菌落直接鏡檢和真菌熒光染色制片，初步鑒定為尖端賽多孢子菌。本文是國(guó)內(nèi)少見(jiàn)用真菌熒光染色技術(shù)制片尖端賽多孢子菌，圖5可清晰見(jiàn)到發(fā)出亮藍(lán)色的真菌菌絲和孢子，形態(tài)典型。尖端賽多孢子菌所致的腦部感染病理資料也是比較少見(jiàn)，如圖2所示，清晰可見(jiàn)腦部組織中有真菌菌絲和孢子感染。DNA檢測(cè)技術(shù)是最為可靠的檢測(cè)手段，也是國(guó)際承認(rèn)的菌株鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，該菌從基因庫(kù)菌株比對(duì)尖端賽多孢子菌結(jié)果為99%，更加明確了診斷，對(duì)臨床診治提供很大的幫助。

圖1入院時(shí)患者頭顱和胸部CT檢查結(jié)果圖2腦部病理組織學(xué)檢查結(jié)果圖3引流物標(biāo)本直接鏡檢和真菌純培養(yǎng)鏡檢 (×40)圖4尖端賽多孢子菌5 d培養(yǎng)和10 d培養(yǎng)圖5引流物標(biāo)本直接鏡檢和真菌純培養(yǎng)鏡檢 (×40)圖6尖端賽多孢子菌熒光染色 (a.×10,b.×40)

Fig.1Head and chest CT results at admissionFig.2Histopathological examination of the brainFig.3Direct microscopy and fungal culture microscopic examination of drainage specimens (×40)Fig.45 d and 10 d culture results ofScedosporiumapiospermumFig.5Direct microscopy and fungal culture microscopic examination of drainage specimens (×40)Fig.6Fluorescence staining ofScedosporiumapiospermum(a.×10,b.×40)

資料表明[9]，抗真菌治療和手術(shù)去除膿腫對(duì)尖端賽多孢子菌感染的治療具有雙管齊下的作用。目前常用的抗真菌類藥物如伊曲康唑、氟康唑等在體外表現(xiàn)出較低的尖端賽多孢子菌的抑菌活性，而新型的三唑類藥物、伏立康唑等具有較高的生物敏感性，這與本文藥敏試驗(yàn)兩性霉素B和氟康唑耐藥，伏立康唑敏感相符合。目前，F(xiàn)DA (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)已批準(zhǔn)伏立康唑用于治療尖端賽多孢菌的感染[10]。同時(shí)也有報(bào)道采用腦脊液引流和抗真菌聯(lián)合用藥 (如伏立康唑、特比萘芬和卡泊芬凈)，成功治愈尖端賽多孢子菌顱內(nèi)感染[11]。本例患者在腦部膿腫摘除后，在ICU給予伏立康唑治療4周后，肺部感染改善，腦部腫脹消退，生命體征基本穩(wěn)定，患者病情得到了很好的控制。可見(jiàn)使用伏立康唑抗真菌治療同時(shí)使用免疫抑制劑，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)等輔助治療對(duì)治療尖端賽多孢子菌感染有很大的幫助。