王航 閻瀾

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員八隊(duì)，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

近年來(lái)，隨著廣譜抗生素的長(zhǎng)期使用，腫瘤患者放化療治療增加、免疫抑制劑使用增多，臨床侵襲性真菌感染發(fā)病率有顯著提高的趨勢(shì)。白念珠菌是一種定植于人體內(nèi)的機(jī)會(huì)致病菌，在患者手術(shù)后、免疫系統(tǒng)功能低下或長(zhǎng)時(shí)間使用外源材料導(dǎo)入時(shí)，會(huì)有很大概率引發(fā)念珠菌血癥等臨床感染，約占醫(yī)院獲得性敗血癥病例的15%[1]，死亡率高達(dá)30%～40%。經(jīng)典抗真菌藥物有唑類(lèi)、棘白菌素類(lèi)、多烯類(lèi)等，唑類(lèi)藥物通過(guò)抑制真菌細(xì)胞膜麥角甾醇生物合成起效，棘白菌素類(lèi)藥物通過(guò)抑制細(xì)胞壁葡聚糖合成關(guān)鍵酶達(dá)到抗真菌效果，以?xún)尚悦顾谺為代表的多烯類(lèi)藥物則與細(xì)胞膜麥角甾醇結(jié)合，形成細(xì)胞膜孔道使細(xì)胞外液內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹死亡。但隨著傳統(tǒng)抗真菌藥物的長(zhǎng)期使用，臨床出現(xiàn)越來(lái)越嚴(yán)重的菌株耐藥。了解白念珠菌耐藥機(jī)制對(duì)于藥物研發(fā)有指導(dǎo)作用。本文就白念珠菌經(jīng)典耐藥途徑和耐藥機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

1 靶酶含量變化或結(jié)構(gòu)變異

靶酶指的是藥物發(fā)揮作用過(guò)程中結(jié)合的特定酶，其含量變化或結(jié)構(gòu)變異均會(huì)影響白念珠菌的耐藥性。唑類(lèi)藥物作用的靶酶為羊毛甾醇C14α-去甲基化酶，棘白菌素類(lèi)藥物作用的靶酶為β-1,3-葡聚糖合成酶。

麥角甾醇是維持細(xì)胞膜完整性的重要成分，羊毛甾醇14α-去甲基化酶是麥角甾醇合成的關(guān)鍵酶，其編碼基因?yàn)镋RG11。ERG11突變或過(guò)度表達(dá)對(duì)于唑類(lèi)藥物的耐藥有重要影響。ERG11基因的錯(cuò)義突變?cè)谂R床分離的耐藥菌株中普遍存在[2]，常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為R467K、Y132H、1471T、S405F和T315A，這些基因突變可單個(gè)或聯(lián)合發(fā)生。近年來(lái)鋅簇轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的耐藥性研究越來(lái)越深入，Upc2p為調(diào)節(jié)ERG11基因表達(dá)的鋅簇轉(zhuǎn)錄因子之一。Upc2p中A643V、G648D、G648S、Y642F等位點(diǎn)突變與ERG11基因過(guò)度表達(dá)有關(guān)，且功能獲得性突變 (gain of function，GOF)在臨床耐藥株中普遍存在。相反的，有研究發(fā)現(xiàn)，UPC2基因GOF突變對(duì)于耐藥性的形成作用微弱，其靶蛋白Mdr1p表達(dá)僅增加到敏感株的2.5倍[3]，在人工構(gòu)建突變株中，ERG11基因的表達(dá)與UPC2無(wú)相關(guān)性。也有研究認(rèn)為，ERG11過(guò)表達(dá)只是一種適應(yīng)性改變，和耐藥性無(wú)關(guān)聯(lián)。由于ERG11過(guò)表達(dá)機(jī)制比較復(fù)雜，相信隨著研究深入和更多調(diào)控基因和位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)通路會(huì)更加完善。

由ERG3基因編碼的甾醇△-5,6-去飽和酶 (sterol△5,6-desaturase)是麥角甾醇后期合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，ERG3基因缺陷或無(wú)義突變可減少麥角甾醇的合成，但中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成的麥角甾-7,22-二烯醇 (ergosta-7,22-dienol)可部分代替麥角甾醇功能，白念珠菌不會(huì)因此死亡，反而導(dǎo)致耐藥性的形成[4]。由此啟發(fā)我們，未來(lái)研發(fā)抗真菌藥物可從酶抑制劑入手，降低酶更新速率，抑制替代途徑對(duì)菌株活性影響等。部分研究發(fā)現(xiàn)[5]，臨床分離耐藥菌株中無(wú)ERG3基因突變，因此對(duì)于ERG3基因突變與臨床耐藥的關(guān)系仍待進(jìn)一步研究。

棘白菌素通過(guò)抑制β-1,3-葡聚糖合成酶來(lái)阻斷真菌細(xì)胞壁葡聚糖的生物合成，造成細(xì)胞壁完整性缺陷。抗性表型通過(guò)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，白念珠菌可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)各種應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程。鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Cas5p是細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，由磷酸酶Glc7p激活，對(duì)于棘白菌素耐藥性形成有重要作用。Cas5p純合缺失降低了FKS1突變菌株的耐藥性，使卡泊芬凈最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration,MIC)由30.72 ng/mL降低至3.84 ng/mL。這一點(diǎn)也暗示Cas5p是介導(dǎo)棘白菌素耐藥性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，此外Cas5p也參與細(xì)胞周期調(diào)控[6]，有助于細(xì)胞有足夠時(shí)間從環(huán)境應(yīng)激中恢復(fù)。

2 外排泵活性增強(qiáng)

白念珠菌細(xì)胞膜存在外排泵，介導(dǎo)藥物分子的外排。白念珠菌外排泵分兩種：ATP能量依賴(lài)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族 (ATP-binding cassette transporter，ABC)和易化擴(kuò)散載體蛋白超家族 (major facilitator superfamily，MFS)。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因突變使外排泵活性增強(qiáng)。常見(jiàn)編碼基因?yàn)镃DR1～CDR10，其中CDR1與CDR2在調(diào)節(jié)耐藥過(guò)程中發(fā)揮主要作用。Cdr1p，Cdr2p過(guò)度表達(dá)時(shí)念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物耐藥，該過(guò)程中Cdr1p起主要作用。Tac1p為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)鍵調(diào)控因子，TAC1基因GOF突變可導(dǎo)致Cdr1p、Cdr2p過(guò)度表達(dá)[7]，共16個(gè)GOF突變位點(diǎn)分布在12個(gè)不同氨基酸，且這些氨基酸大多位于TAC1基因C-端。其中，R688Q位點(diǎn)突變僅導(dǎo)致Cdr2p表達(dá)上調(diào)[8]。

MFS為一類(lèi)通過(guò)電化學(xué)勢(shì)能被動(dòng)運(yùn)輸?shù)妮d體，介導(dǎo)疏水性藥物排出。Mdr1p和Flu1p均為白念珠菌耐藥相關(guān)的MFS蛋白。鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Mrr2p參與TAC1介導(dǎo)的耐藥性，MRR2基因GOF突變包括S466L、T470N位點(diǎn)突變[9]。經(jīng)證實(shí)Rep1p對(duì)于MDR1起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，Mrr1p為正向調(diào)節(jié)作用，兩者靶酶相同，但互不影響，可能Rep1p與Mrr1p作用于靶酶的不同部位。FLU1作用與CDR1類(lèi)似，但其mRNA含量遠(yuǎn)低于后者，故由其介導(dǎo)的耐藥性較弱。Cph1p作為MDR1特異性轉(zhuǎn)錄抑制子，起負(fù)向調(diào)控功能，其無(wú)義突變導(dǎo)致MDR1基因表達(dá)上調(diào)，并降低對(duì)氟康唑敏感性，但對(duì)于兩性霉素B沒(méi)有影響[10]，兩性霉素B對(duì)突變株和敏感株均在0.125 mg/L時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生抑制作用。雖然有大量文獻(xiàn)證實(shí)外排泵相關(guān)基因高表達(dá)與吡咯類(lèi)藥物耐藥相關(guān)，但在女性生殖道感染臨床分離株中CDR1、CDR2、MDR1基因表達(dá)并無(wú)顯著性差異[11]。MDR1轉(zhuǎn)錄調(diào)控是順式作用元件和反式調(diào)節(jié)因子共同作用的結(jié)果，具體機(jī)制仍未完全闡明。

3 鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路激活

鈣調(diào)神經(jīng)蛋白在白念珠菌中起毒力調(diào)控、反應(yīng)應(yīng)激等作用。鈣調(diào)磷酸酶可作用于特定靶蛋白，Crz1p是目前已明確的唯一調(diào)控鈣調(diào)磷酸酶的轉(zhuǎn)錄因子。外界環(huán)境應(yīng)激會(huì)增加胞質(zhì)鈣濃度，激活鈣調(diào)磷酸酶通路 (Calcium Cell Survival，CCS)。CCS途徑即由白念珠菌Crz1p介導(dǎo)的鈣依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄途徑，該途徑受損會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激敏感性提高，真菌存活能力下降。Crz1p雖然與壓力應(yīng)答有關(guān)，但Crz1基因缺失并不會(huì)導(dǎo)致真菌致死性損傷[12]，據(jù)此推測(cè)參與調(diào)節(jié)的其他關(guān)鍵蛋白仍未被發(fā)現(xiàn)或該調(diào)節(jié)通路可通過(guò)多種靶蛋白激活。白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)表明RTA2基因編碼一種具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白，在耐藥菌株中表達(dá)上調(diào)，參與鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)的耐藥性形成。鈣調(diào)磷酸酶也通過(guò)減少氟康唑?qū)|(zhì)膜的損傷而形成耐藥性，為抗真菌治療提供新靶點(diǎn)。

熱休克蛋白Hsps存在于大多數(shù)生物體，可通過(guò)不同信號(hào)途徑相互作用，調(diào)控白念珠菌生物活性、細(xì)胞周期、耐藥性等。熱休克蛋白90 (Hsp90)是一種高度保守的分子伴侶，在蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，為研究最為深入的Hsps之一。Hsp90參與白念珠菌對(duì)唑類(lèi)和棘白菌素類(lèi)藥物耐藥性的形成，該過(guò)程與鈣調(diào)磷酸酶有關(guān)，鈣調(diào)神經(jīng)蛋白是依賴(lài)于Hsp90的耐藥性形成關(guān)鍵蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Hsp90抑制劑與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用有助于提高對(duì)于耐藥白念珠菌的療效，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)24 h菌群計(jì)數(shù)相對(duì)于氟康唑單用減少53%，且在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性[13]，顯示出治療白念珠菌感染的臨床應(yīng)用前景。Hsp70在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中高度保守，生化特性相似，發(fā)揮雙重作用。細(xì)胞表面Ssa1p與Ssa2p為Hsp70家族主要成員，一方面，Ssa1p、Ssa2p誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用，使白念珠菌毒力增強(qiáng)；另一方面，Ssa1p、Ssa2p與唾液組胺素Hst5p親和力高，促進(jìn)Hst5p進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮抗真菌特性，減弱白念珠菌毒力。隨著研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，Hsps參與調(diào)控MAPK通路，Ras1-cAMP-PKA信號(hào)通路和細(xì)胞周期信號(hào)通路等，這些通路對(duì)于白念珠菌活性和毒力形成有重要作用。未來(lái)抗真菌藥更大可能性專(zhuān)注于聯(lián)合治療以提高療效和延長(zhǎng)耐受時(shí)間。

4 生物膜形成

隨著人工器械和醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，形成生物被膜的白念珠菌更能有效抵御抗真菌藥物。白念珠菌形成生物被膜后，氟康唑?qū)ζ銶IC值最高可上升幾百倍。生物膜主要由細(xì)胞外基質(zhì)包裹真菌細(xì)胞形成，黏附于生物或非生物表面，如植入裝置，關(guān)節(jié)假肢，機(jī)械心臟瓣膜等。

Nobile等[14]最早發(fā)現(xiàn)HWP1基因缺失菌產(chǎn)生的生物膜量比野生菌株減少73.8%，且菌絲形成量也相對(duì)減少，這些證明HWP1為白念珠菌體內(nèi)生物膜形成必需基因，同時(shí)HWP1基因表達(dá)受鋅簇轉(zhuǎn)錄因子Bcr1p調(diào)控。生物膜可能通過(guò)抑制毒性物質(zhì)大量釋放，產(chǎn)生耐藥性[15]，但Hsp90缺失會(huì)使生物膜耐藥性喪失，細(xì)胞外基質(zhì)中葡聚糖的含量也會(huì)變少。大量研究表明，完整菌絲形態(tài)發(fā)生途徑對(duì)于積累生物膜量有至關(guān)重要的作用。念珠菌菌絲可表達(dá)多種黏附素，其黏附能力部分決定生物膜穩(wěn)定性。凝集素樣序列 (ALS)基因家族在生物膜早期形成和黏附過(guò)程中起重要作用[16]，轉(zhuǎn)錄因子Sfp1p負(fù)向調(diào)控ALS1，ALS3和HWP1，而轉(zhuǎn)錄因子Bcr1p和Efpg1p均為正向調(diào)控。甘油-3-磷酸酶合成基因 (RHR2)是生物膜調(diào)節(jié)基因之一，該調(diào)節(jié)過(guò)程與甘油合成改變有關(guān)，可能與甘油通過(guò)促分裂原活化蛋白激酶 (Hog1)途徑維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓有關(guān)。生物膜細(xì)胞基因表達(dá)與低氧環(huán)境下基因表達(dá)有明顯相關(guān)性，缺乏完整生物膜的細(xì)胞對(duì)于低氧耐受性較差，據(jù)此推測(cè)，生物膜內(nèi)細(xì)胞處于缺氧代謝狀態(tài)。在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的生物膜中，ICL1 (異檸檬酸裂合酶基因)和PCK1 (磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因)的乙醛酸和葡萄糖異生相關(guān)轉(zhuǎn)錄物增多，在抗真菌藥物停止使用后，高度耐藥細(xì)胞會(huì)重新填充生物膜，這對(duì)于真菌感染長(zhǎng)期治療造成很大阻力，是臨床實(shí)際治療中不可忽視的問(wèn)題。生物膜的細(xì)胞異質(zhì)性廣泛存在，形成和調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜多樣，仍有許多相關(guān)小分子作用機(jī)制不明，有望成為治療的新靶點(diǎn)。

5 線(xiàn)粒體氧化呼吸抑制

近年來(lái)，本課題組研究[17-18]認(rèn)為線(xiàn)粒體功能也參與白念珠菌耐藥性的形成。由敏感親本菌經(jīng)氟康唑連續(xù)傳代培養(yǎng)，直到60多代后獲得耐藥子代，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定在菌株耐藥性形成過(guò)程中發(fā)生改變的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異蛋白涉及能量代謝，包括糖酵解 (Pgk1p)、發(fā)酵 (Adh1p)、三羧酸循環(huán) (Idh1p)等。研究還證實(shí)，白念珠菌線(xiàn)粒體膜電位降低導(dǎo)致氧化磷酸化受阻，ATP水平下降，細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平下降，進(jìn)而造成菌株對(duì)唑類(lèi)藥物耐受。進(jìn)一步研究表明，線(xiàn)粒體Aox酶是替代途徑 (抗氰呼吸)中減少性活性氧ROS的產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，且該替代呼吸 (抗氰呼吸)途徑會(huì)使白念珠菌對(duì)唑類(lèi)敏感性降低，當(dāng)用SHAM抑制Aox酶途徑時(shí)，ROS產(chǎn)量增加，對(duì)唑類(lèi)敏感性也得到恢復(fù)，但SHAM抑制劑臨床意義仍待驗(yàn)證[19]。

6 其他途徑

白念珠菌中存在四種MAPK途徑：Hog途徑、Mkc1途徑、Cek1途徑和Cek2途徑。其中Hog途徑參與適應(yīng)外界氧化壓力和滲透壓力，對(duì)于其研究有助于新抗菌藥物的研制。Hog-MAPK信號(hào)通路中，耐藥株HOG1、SHP1、SSK1、PBS1基因mRNA表達(dá)量是敏感株兩倍以上，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[20]。真菌細(xì)胞染色體發(fā)生丟失或增加，也可導(dǎo)致真菌耐藥性變化。白念珠菌的8條染色體中R染色體的三倍體可促進(jìn)菌株耐藥性產(chǎn)生[21]。反轉(zhuǎn)座子Zorro2可被咪康唑誘導(dǎo)激活并發(fā)生轉(zhuǎn)座，進(jìn)而參與白念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐受[22]，過(guò)程可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS)積累有關(guān)。

白念珠菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制復(fù)雜，盡管有研究表明一些化合物具有體外抗耐藥真菌活性，但只是為藥物開(kāi)發(fā)提供了一些研究思路，距離進(jìn)入臨床應(yīng)用還十分遙遠(yuǎn)。目前對(duì)耐藥現(xiàn)象的防治主要從兩方面著手：早期以預(yù)防為主，減少臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥；在治療階段，合理聯(lián)合用藥，控制抗真菌藥的使用量，最大程度發(fā)揮藥物作用，避免濫用，以達(dá)到最佳治療效果。