趙曉霞 馮文莉

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，太原 030001)

白念珠菌 (Candidaalbicans，C.albicans，CA.)是人體常見的條件致病真菌，在免疫力低下的患者中可以引起機體淺部或系統(tǒng)性的感染。如艾滋病患者口腔和食管的感染有很高的發(fā)病率，可嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量；其他因素諸如免疫抑制治療、重大手術(shù)或靜脈內(nèi)置管都可引起系統(tǒng)性念珠菌感染，而且往往是致命性的。在健康的個體，白念珠菌也可以引起慢性的淺表感染，典型的例子就是念珠菌性外陰陰道炎。另外，在許多情況下白念珠菌只是黏附在宿主表面，并不引起明顯的疾病，稱為定植。由此可見，白念珠菌與宿主之間相互作用的機制十分復(fù)雜，盡管在這些作用過程中宿主的因素起著很大的作用，但是，白念珠菌的黏附功能也起了較關(guān)鍵的作用，而與黏附功能相關(guān)的黏附素、酶及相關(guān)蛋白都是由黏附基因編碼的。本文就白念珠菌黏附基因研究的新進展作以下綜述。

1 凝集素樣序列基因3(Agglutinin-Like Sequence 3，ALS3)

凝集素樣序列基因家族 (Agglutinin-Like Sequence，ALS)編碼序列高度相似的細(xì)胞表面糖蛋白。ALS1-4編碼專門用于生殖管和菌絲的黏附素，而ALS5-7和ALS9與芽生孢子相關(guān)。最常報道的基因是ALS1，ALS3和ALS5，它們具有廣泛的底物特異性，從而介導(dǎo)了對各種宿主成分的依從性，在細(xì)胞黏附和宿主侵襲中起重要作用，有助于疾病的進展[1]。

在其編碼的蛋白質(zhì)中，關(guān)于Als3p的研究最多，其主要功能是幫助白念珠菌定殖于宿主。Als3p從50末端的信號肽開始，到30末端的糖基磷脂酰肌醇 (GPI)錨定位點結(jié)束。ALS3基因的啟動子含有兩個抑制區(qū) (R1和R2)和兩個激活區(qū) (A1和A2)。ALS3基因的表達(dá)在生殖管誘導(dǎo)條件下增加，并受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，包括Rlm1p、Efg1p、Rim101p和Bcr1p[2-3]。

Als3p作為黏附素具有廣泛的底物特異性，介導(dǎo)白念珠菌與多種宿主細(xì)胞的附著，例如上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和植入材料 (如導(dǎo)管等)。此外，Als3p與Hwp1p (Hyphal Wall Protein1，1型菌絲壁蛋白)和Eap1p (Enhanced Adherence to Polystyrene，聚苯乙烯黏附增強蛋白)一起構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，從而形成互補的黏附功能。另外，白念珠菌Als3p具有高度保守的淀粉樣蛋白形成序列，這使得白念珠菌更趨向于聚集成群，而不是黏附于人類細(xì)胞[4]。此外，研究發(fā)現(xiàn)ALS3介導(dǎo)白念珠菌對金黃色葡萄球菌的依附并促進白念珠菌和戈登鏈球菌 (Streptococcusgordonii,S.gordonii)形成混合物種生物膜[5-6]。白念珠菌Als3p與人細(xì)胞的黏附需要肽結(jié)合腔 (PBC)，Als3pPBC的突變導(dǎo)致白念珠菌無法黏附于上皮細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，類似于無效突變體[7-8]。相比之下，Cleary等[9]發(fā)現(xiàn)Als3p對于流動模型下的黏附是不必要的，部分原因是因為在這樣的條件下，菌絲特異性基因如ECE1和HWP1仍然被適當(dāng)誘導(dǎo)。這是迄今為止關(guān)于Als3p在黏附方面起次要作用的唯一報道。

除了幫助白念珠菌定植宿主外，Als3p也是真菌入侵宿主所必需的。有研究證實它通過與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVECs)上的N-鈣粘蛋白或口腔上皮細(xì)胞上的E-粘鈣素 (Ecadherin)結(jié)合誘導(dǎo)內(nèi)吞作用[10]。Als3p還可以結(jié)合獨特的受體，然后侵入人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (HBMECs)[11]。在白念珠菌和光滑念珠菌的陰道上皮共感染模型中，白念珠菌Als3p被確定為促進光滑念珠菌的侵襲、定植和組織損傷所需的因子[12]。

Morenoruiz 等[13]認(rèn)為，白念珠菌Als3p作為抗宿主防御的高分子量激肽原 (HK)受體，可促進白念珠菌生物膜形成以維持細(xì)胞壁功能。并且，ALS3與白念珠菌從哺乳動物宿主中的血紅蛋白、鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白中獲得鐵有密切關(guān)系[14-16]。促進白念珠菌與宿主細(xì)胞鐵蛋白的結(jié)合，以獲得鐵作為營養(yǎng)物，從而在很大程度上逃避了宿主的攻擊。

ALS3與白念珠菌生物膜形成密切相關(guān)，其在大多數(shù)實驗室生物膜模型系統(tǒng)中表達(dá)均上調(diào)[17]。白念A(yù)ls3null突變體通常在RPMI1640或Lee's培養(yǎng)基中形成菌絲，在小鼠系統(tǒng)性感染模型中具有野生型毒力，但缺乏生物膜形成。ALS3的過表達(dá)在體外和大鼠靜脈導(dǎo)管模型中彌補了bcr1D/D突變體中的生物膜形成的缺陷[18]。在有機硅生物材料上，人血清促進白念珠菌生物膜的生長，并且ALS3的表達(dá)增加[19]。

Als3p是參與白念珠菌致病過程的重要因子之一，近年來成為抗白念珠菌病的疫苗和抗體的特定靶標(biāo)。Als3p特異性抗體包括單克隆抗體 (MAb)3-A5，MAb113和scFv3，此外，還有MAbC7，MAb3D9.3和MAb2G8等。靶向Als3pN末端的NDV-3疫苗已進入2期臨床試驗[20-23]。這些抗體和疫苗未來有望成為高效的新型抗真菌藥物。

2 1/2型菌絲壁蛋白(Hyphal Wall Protein 1/2，Hwp1/2)

白念珠菌的菌絲胞壁蛋白基因1 (HWP1)編碼真菌細(xì)胞壁蛋白，該蛋白是菌絲發(fā)育和酵母黏附于上皮細(xì)胞、生物膜形成和毒力所需的，也是第一個被發(fā)現(xiàn)在生物膜形成過程中所需的蛋白質(zhì)。HWP1基因缺失的白念珠菌不能與人類口腔上皮細(xì)胞形成由穩(wěn)定的共價結(jié)合介導(dǎo)的黏附，但對白念珠菌總的黏附率影響卻較小。研究表明，Hwp1可以通過與Als1p和Als3p結(jié)合介導(dǎo)白念珠菌菌絲之間的黏附，這對于生物膜的形成至關(guān)重要。

Hwp1由Kex2內(nèi)切蛋白酶調(diào)節(jié)，其本身也調(diào)節(jié)白念珠菌蛋白酶的活性。此外，Hwp1在N末端富含谷氨酰胺殘基，這些是哺乳動物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物，在體外形成Hwp1與宿主細(xì)胞表面蛋白之間的交聯(lián)，從而介導(dǎo)菌絲對宿主上皮細(xì)胞的穩(wěn)定附著。在口腔白念珠菌病患者和陰道念珠菌病患者的臨床分離菌株中，均檢測到Hwp1較高的表達(dá)[24]。

在HWP1中，激活和抑制黏附均涉及到的368 bp區(qū)域，稱為HWP1控制區(qū)域 (HCR)，位于其轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 410 bp處，其介導(dǎo)的激活和抑制局限于由轉(zhuǎn)錄因子Nrg1p和Efg1p靶向作用的不同HCR區(qū)域。但Kim等[25]認(rèn)為，HCR不僅確保Hwp1在細(xì)胞群體中的均勻表達(dá)，HCR的獨立表達(dá)也存在。此外，HWP1的長5'基因間區(qū)域上游在產(chǎn)生mRNA亞型中起作用，而mRNA亞型對形態(tài)學(xué)特異性基因的表達(dá)十分重要。 Staab等[26]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Hwp1將影響白念珠菌從小鼠腸道向血流的遷移。

另外，真菌血紅素 (FC)、抗血栓藥物舒必特、乳酸桿菌代謝物、合成抗菌肽dermaseptin-S1、健康陰道相關(guān)的優(yōu)勢乳桿菌種L.crispatus、光動力療法、十一碳烯酸等可以抑制菌絲特異性基因 (ALS3，HWP1)的表達(dá)[27-33]。卷煙煙氣冷凝物 (CSC)可增加HWP1、EAP1的表達(dá)[34]。HWP1基因型影響真菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)以及其與小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，而生物膜的形成不受影響[35]。

Hwp2是GPI錨定的細(xì)胞壁蛋白，它與白念珠菌的毒力、黏附性、生物膜形成、過氧化氫應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[36]。HWP1、HWP2和RBT1的表達(dá)是菌絲特異性的，在不透明細(xì)胞交配過程中會上調(diào)。Peter Hayek等[37]鑒定的Hwp2的AIVVT序列與Als9具有96%聚集潛力的IIVVTT序列具有高度相似性，并且與Rbt1和Hwp1中的相似序列具有高度同源性。Hwp2與Rbt1、Hwp1的多重序列比對表明，在每種蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)兩次相似的37個氨基酸長序列相似區(qū)域 (大于60%同一性)，這種37個氨基酸長序列可能是黏附和侵入性生長中涉及的關(guān)鍵序列。

3 聚苯乙烯黏附增強蛋白1 (Enhanced Adherence to Polystyrene 1，Eap1)

白念珠菌Eap1p是GPI-CWP家族的成員。EAP1在酵母和菌絲細(xì)胞中均表達(dá)，并在酵母表型轉(zhuǎn)換期間被差異調(diào)節(jié)。EAP1的表達(dá)受正負(fù)調(diào)控，Sir介導(dǎo)的沉默使其在細(xì)胞間表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性。Eap1p有助于生物膜形成，其不同區(qū)域介導(dǎo)了白念珠菌對不同底物的黏附，例如與一般上皮細(xì)胞、聚苯乙烯的黏附[38]。其N-末端結(jié)構(gòu)域促進細(xì)胞-細(xì)胞接觸和對哺乳動物細(xì)胞的黏附，Ser/Thr富集重復(fù)區(qū)有助于聚苯乙烯黏附。EAP1的表達(dá)增強了釀酒酵母對HEK293腎上皮細(xì)胞和聚苯乙烯的附著，并且在介導(dǎo)釀酒酵母和白念珠菌細(xì)胞之間的相互作用中發(fā)揮著作用。EAP1基因缺失的菌株對聚苯乙烯和HEK293腎上皮細(xì)胞的黏附下降近50%，并且在體外只能形成由數(shù)層酵母細(xì)胞組成的被膜。與Als3p類似，Eap1和Hwp1可以促進白念珠菌結(jié)合到S.gordonii。S.gordonii的特征是表面具有類似淀粉樣蛋白序列的蛋白質(zhì)，但Als3p和Eap1的黏附功能不依賴于淀粉樣蛋白形成[12]，表明這種結(jié)合是靠N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域而不是靠重復(fù)單位介導(dǎo)的。

4 IFF/HYR家族

白念珠菌IFF/HYR基因家族編碼12種蛋白質(zhì) (“IFF”代表“IPF家族F”，“HYR”表示“菌絲上調(diào)蛋白質(zhì)基因”)，在這12個成員中，有11個被鑒定為GPI錨定蛋白，從而形成了真菌細(xì)胞壁蛋白最主要的一類，所有蛋白質(zhì)均顯示高度保守的360-氨基酸N-末端結(jié)構(gòu)域[39]。Iff2/Hyr3是首個通過二硫鍵與細(xì)胞壁相連的GPI修飾蛋白。IFF/HYR基因家族中Iff1/Rbr3，Iff2/Hyr3，Iff3，Iff5，Iff7/Hyr4和Iff9共享41至51個氨基酸長的Iff特異性串聯(lián)重復(fù)序列[40]。該家族包括菌絲特異性蛋白Hyr1和Iff11，Iff11代表了一種分泌蛋白，其缺失導(dǎo)致細(xì)胞壁顯著改變，表明該蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁組織和/或酶功能中發(fā)揮作用[41]。在完整細(xì)胞上進行的免疫熒光顯微鏡檢查表明，Iff2/Hyr3 (580個氨基酸)，Iff3，Iff5和Iff6在細(xì)胞表面暴露，而Iff8 (具有最小的Ser/Thr富集結(jié)構(gòu)域，340個氨基酸)嵌入葡聚糖聚合物中。這些蛋白質(zhì)的預(yù)測長度表明，蛋白大小對是否可以暴露于細(xì)胞表面有直接影響。Iff/Hyr家族蛋白質(zhì)的分子底物尚未確定，但它們具有重要的臨床意義。IFF4的過度表達(dá)增強了菌體對塑料和上皮細(xì)胞的黏附[42]，IFF4的無效突變體對塑料的黏附性降低[43]。在動物模型中，IFF4的過表達(dá)和低表達(dá)均導(dǎo)致毒力降低，表明特定的表達(dá)水平是最大毒力所需的[44]。 Hyr1參與抵抗中性粒細(xì)胞對菌體的殺傷作用，抗Hyr1抗體(AB)可增強小鼠對播散性念珠菌病的免疫[45]。

5 1型整合素基因 (Integrin 1, INT1)

INT1基因編碼的蛋白質(zhì)有1 659個氨基酸，其在體外和體內(nèi)均參與對上皮細(xì)胞的黏附。Int1是一種白念珠菌細(xì)胞表面蛋白，與脊椎動物的整合素具有部分的相似，起初被認(rèn)為是白念珠菌與宿主細(xì)胞發(fā)生黏附的受體。Orellanamuoz等[46]發(fā)現(xiàn)Int1的C端對于維持細(xì)胞質(zhì)分裂過程中雙重septin環(huán)的穩(wěn)定性是必不可少的。Int1和Sep7的共同作用可維持細(xì)胞倍性。INT1和SEP7突變體的核分裂和胞質(zhì)分裂都不能正常發(fā)生。目前已經(jīng)確定Int1是一種新的septin調(diào)節(jié)劑，其可能作為支架蛋白來穩(wěn)定septin。Int1和Sep7通過充當(dāng)Lte1 (MEN的激活劑)的擴散屏障而在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用。

Shahin-Jafari等[39]的研究結(jié)果強調(diào)了900 MHz移動電話輻射對α-INT1基因擴增或序列變異的無效性。在體內(nèi)，Int1中的基序1的賴氨酸K805/K806對于中心靜脈導(dǎo)管中的生物膜形成是必需的，針對基序1的IgG抗體可抑制生物膜形成[47]。將INT1轉(zhuǎn)入釀酒酵母中表達(dá)可以使酵母細(xì)胞與HeLa細(xì)胞發(fā)生黏附；在白念珠菌中破壞INT1的兩個拷貝可減少菌體對HeLa細(xì)胞的黏附；INT1對于小鼠模型中菌絲形態(tài)發(fā)生和毒力是必需的，將白念珠菌的INT1基因敲除后可以抑制菌絲的生長、減弱菌體與上皮細(xì)胞的黏附以及降低白念珠菌對小鼠的致病力[48]。

6 結(jié) 語

白念珠菌的黏附特性是其致病力的重要因素，也是其致病機制的重要組成部分。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些黏附相關(guān)的基因，他們的表達(dá)導(dǎo)致白念珠菌產(chǎn)生一系列表面蛋白、調(diào)控因子，從而使白念珠菌產(chǎn)生黏附力，除此之外許多研究也發(fā)現(xiàn)黏附基因有許多其他功能，如參與調(diào)控細(xì)胞的分裂等。而它們真正的作用機制、更多的生理功能以及彼此之間是否存在表達(dá)調(diào)控尚待深入探討闡明，以期為研制新的抗真菌藥物和真菌疫苗提供理論依據(jù)。