王曉萍+周明旺+康開彪+顏春魯+李妍怡

摘要：目的 觀察岷當(dāng)歸3種有效成分（當(dāng)歸揮發(fā)油、當(dāng)歸多糖、阿魏酸）對高同型半胱氨酸血癥致兔動脈粥樣硬化（AS）的影響，探討其作用機制。方法 日本大耳白兔48只，隨機分為正常組、模型組、當(dāng)歸揮發(fā)油組、當(dāng)歸多糖組、阿魏酸組和葉酸維生素組，每組8只。采用DL-蛋氨酸皮下注射法建立高同型半胱氨酸血癥兔模型，造模8周后各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，12周后檢測各組兔血清同型半胱氨酸（Hcy）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，觀察兔腹主動脈病理變化。結(jié)果 模型組較正常組Hcy水平明顯升高（P<0.05）；當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿魏酸組、葉酸維生素組Hcy水平較模型組明顯降低（P<0.05）；當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿魏酸組TC、TG、LDL-C水平較模型組明顯降低（P<0.05）。腹主動脈組織學(xué)檢查顯示，模型組AS征象明顯，葉酸維生素組、當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿魏酸組病變程度較模型組減輕。結(jié)論 岷當(dāng)歸有效成分當(dāng)歸揮發(fā)油和阿魏酸能減輕模型兔血管內(nèi)皮的損傷，對高同型半胱氨酸血癥致兔AS病變有防治作用。

關(guān)鍵詞：高同型半胱氨酸血癥；動脈粥樣硬化；當(dāng)歸揮發(fā)油；當(dāng)歸多糖；阿魏酸；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.012

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0051-04

Effects of the Effective Constituents of Min Angelicae Sinensis Radix on Hyperhomocysteinemia Induced Rabbit Atherosclerotic Lesions

WANG Xiao-ping1， ZHOU Ming-wang1， KANG Kai-biao2， YAN Chun-lu3， LI Yan-yi1

1. Gansu Provincial Hospital of Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China； 2. Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China； 3. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To observe the effects of three effective constituents of Min Angelicae Sinensis Radix on hyperhomocysteinemia （HHcy） induced rabbit atherosclerotic lesions （AS）. Methods Forty eight Japanese big ear rabbits were randomly divided into normal group， model group， Angelicae Sinensis Radix volatile oil group， Angelicae Sinensis Radix polysaccharide group， ferulic acid group and folic acid group， with 8 rabbits in each group. The HHcy rabbit model induced AS was duplicated by injected DL-methionine. After 8 weeks， each medication group was given relevant medicine for gavage. After 12 weeks， Hcy， TC， TG， HDL-C and LDL-C level in serum were detected， and abdominal aorta vascular ultrasound were observed. Results The model group was higher than the normal group in the level of Hcy （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of Hcy in Angelicae Sinensis Radix volatileoil group， the ferulic acid group and the folic acid group decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of TC， TG and LDL-C in AngelicaeSinensis Radix volatile oil group， ferulic acid group and folic acid group decreased （P<0.05）. Abdominal aorta ultrasonography showed that the degree of AS was significantly attenuated in folic acid group， Angelicae Sinensis Radix volatile oil group and ferulic acid group. Conclusion Angelicae Sinensis Radix volatile oil and ferulic acid in Min Angelicae Sinensis Radix can reduce the harm to endothelium and can prevent and treat HHcy caused by rabbit AS.endprint

Keywords： hyperhomocysteinemia； atherosclerosis； Angelicae Sinensis Radix volatile oil； Angelicae Sinensis Radix polysaccharide； ferulic acid； rabbits

當(dāng)歸（Angelicae Sinensis Radix）系傘形科植物當(dāng)歸的干燥根，性甘、辛、溫，主要歸肝、心、脾經(jīng)，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效。前期研究表明，以重用岷當(dāng)歸配伍組方的系列制劑如中風(fēng)膏、補腦膏、佛手瓜蔞膠囊等，在治療心腦血管疾病均取得顯著療效[1-3]，大劑量岷當(dāng)歸的使用是這一系列藥品最重要的用藥特色，且其用量達(dá)到了藥典規(guī)定的6倍（90 g），但無明顯毒副作用與不良反應(yīng)[4]。同時，中風(fēng)膏可明顯降低動脈粥樣硬化（AS）家兔模型血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，升高一氧化氮水平，達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗AS的作用[5]。本實驗采用皮下注射DL-蛋氨酸誘導(dǎo)高同型半胱氨酸血癥致兔AS模型，觀察岷當(dāng)歸3個主要有效成分（當(dāng)歸揮發(fā)油、當(dāng)歸多糖、阿魏酸）對高同型半胱氨酸血癥致兔AS的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

成年健康普通級日本大耳白兔48只，雌雄各半，4月齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動物合格證號SCXK（甘）2010-0001。飼養(yǎng)于溫度18～24 ℃、明暗交替12 h/12 h清潔環(huán)境。

1.2 藥物

岷當(dāng)歸飲片購自岷縣中藥材有限公司。岷當(dāng)歸3個有效成分（當(dāng)歸揮發(fā)油、當(dāng)歸多糖、阿魏酸）的提取均在實驗室制備。當(dāng)歸揮發(fā)油：超臨界CO2萃取法提取，萃取溫度40 ℃，萃取壓力，35 MPa，CO2消耗量60 mL，冰水浴收集產(chǎn)品，出油率為1.45%。當(dāng)歸多糖：水煮醇沉法分離提取，石油醚、乙醚除去當(dāng)歸中脂溶性雜質(zhì)，85%乙醇提取除去所含單糖、低聚糖及苷類等干擾性成分后，再用水提醇沉法制得當(dāng)歸粗多糖，提取率為8.77%。阿魏酸：超臨界CO2萃取法提取，藥材粉碎為粒度0.30～0.85 ram，夾帶劑（乙醇）濃度8%，萃取壓力35 MPa，萃取溫度60～45 ℃，HPLC測定阿魏酸含量為0.41 mg/g。葉酸，5 mg/片，天津飛鷹制藥有限公司，批號20140517；維生素B6，10 mg/片，天津力生制藥股份有限公司，批號20140220；維生素B12，25 mg/片，山西云鵬制藥有限公司，批號20130608。

1.3 主要試劑與儀器

DL-蛋氨酸，Sigma公司；同型半胱氨酸（Hcy）試劑盒，北京中生生物工程技術(shù)公司。手術(shù)刀剪（上海手術(shù)器械廠），電子分析天平（德國Sartorius），低速離心機（江蘇金壇儀器廠），顯微鏡（日本奧林巴斯），微量移液器（德國DRAGON公司），超低溫冰箱（海爾公司），酶標(biāo)儀（澳大利亞TECAN公司），全自動生化分析儀（邁瑞全自動生化分析儀）。

1.4 分組和造模

48只兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為正常組、模型組、當(dāng)歸揮發(fā)油組、當(dāng)歸多糖組、阿魏酸組和葉酸維生素組，每組8只。上述各組兔均限食，每兔100 g/d。參照文獻(xiàn)[6]方法制作動物模型，背部皮下注射DL-蛋氨酸80 mg/（kg·d），2 mL/只，連續(xù)12周，標(biāo)準(zhǔn)兔飼料喂養(yǎng)。正常組背部皮下注射等量生理鹽水，標(biāo)準(zhǔn)兔飼料喂養(yǎng)。12周末終止實驗。

1.5 干預(yù)

岷當(dāng)歸提取物各組灌胃劑量參照文獻(xiàn)[7-9]，當(dāng)歸揮發(fā)油100 mg/（kg·d），當(dāng)歸多糖120 mg/（kg·d），阿魏酸2.5 mg/（kg·d）；葉酸維生素組參照文獻(xiàn)[10]，給予葉酸+維生素B6+維生素B12研碎后灌胃，葉酸1.5 mg/（kg·d），維生素B6 20 mg/（kg·d），維生素B12 0.25 mg/（kg·d）。兔每日灌胃藥液用量為10 mL/kg，正常組和模型組給予等量滅菌水灌胃。各給藥組造模第8周開始灌胃，共4周。

1.6 同型半胱氨酸測定

采用ELISA測定，按試劑盒說明書操作。

1.7 脂代謝水平測定

采用全自動生物化學(xué)分析儀測定。

1.8 兔腹主動脈病理觀察

第12周末，空氣栓塞法將實驗兔處死。取髂外動脈約1 cm，縱行拋開，取降主動脈至腹主動脈分叉處血管，置于含10%多聚甲醛固定。取材、脫水、血管橫斷包埋、石蠟切片，光鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSSl7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，組間對比采用獨立樣本t檢驗，組間兩兩比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 岷當(dāng)歸有效成分對模型兔血清同型半胱氨酸的影響

與正常組比較，模型組Hcy水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組、阿魏酸組和葉酸維生素組Hcy水平明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表1。2.2 岷當(dāng)歸有效成分對模型兔血清脂代謝水平的影響

與正常組比較，模型組TC、TG、LDL-C水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，當(dāng)歸揮發(fā)油組和阿魏酸組TC、TG、LDL-C水平明顯降低（P<0.05），葉酸維生素組和當(dāng)歸多糖組TC、TG、LDL-C水平無明顯變化（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 腹主動脈病理變化

正常組血管壁薄且結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑，平滑肌細(xì)胞排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，單側(cè)緊貼內(nèi)彈力板，內(nèi)皮下未見脂質(zhì)及炎性細(xì)胞浸潤，中層平滑肌細(xì)胞排列整齊，呈長橢圓形，外膜結(jié)構(gòu)清楚，未見明顯病理改變；模型組血管壁增厚、變硬，似有增生，內(nèi)中膜增厚，內(nèi)膜下可見泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞增生，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，膠原纖維和彈性纖維增多，內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞浸潤，中層結(jié)構(gòu)紊亂；葉酸維生素組、當(dāng)歸揮發(fā)油組和阿魏酸組病變程度較模型組減輕；當(dāng)歸多糖組病變程度與模型組大致相當(dāng)。結(jié)果見圖1。endprint

3 討論

血漿中Hcy水平升高與心腦血管疾病關(guān)系密切。因環(huán)境因素或遺傳因素而導(dǎo)致Hcy持續(xù)性超高稱之為高同型半胱氨酸血癥，可導(dǎo)致早期血管硬化[11]，使AS相關(guān)基因異常甲基化、細(xì)胞周期失控，從而促進(jìn)AS的發(fā)生及發(fā)展[12]。

甘肅東南部岷縣產(chǎn)的當(dāng)歸氣味濃、油性足、產(chǎn)量大、質(zhì)量最佳，習(xí)稱“岷當(dāng)歸”。當(dāng)歸實際使用過程中的療效并不相同，主要是當(dāng)歸中有效成分差異造成。研究表明，岷當(dāng)歸的水分含量、醇溶出物的含量、揮發(fā)油含量等均優(yōu)于其他產(chǎn)地當(dāng)歸的質(zhì)量[13-15]。當(dāng)歸及其主要化學(xué)成分具有廣泛的生物活性，對造血系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有藥理作用[16]。從當(dāng)歸植物的根、葉、地上部分、根莖、根內(nèi)生菌等已分離鑒定出約165種或多達(dá)213種的化學(xué)成分[17]，主要藥效活性成分包括揮發(fā)油、有機酸、多糖等。當(dāng)歸揮發(fā)油是當(dāng)歸的脂溶性成分，含量約為1%，主要含有藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞，具有抗血小板凝聚、神經(jīng)保護(hù)和鎮(zhèn)痛消炎等作用；阿魏酸是當(dāng)歸中有機酸類化合物的代表，具有補血活血、抗炎和抗血小板聚集、提高機體免疫等多種功能；當(dāng)歸多糖是水溶性有效成分，其含量可達(dá)到15%，具有活血、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等多種功效[18-19]。

研究表明，當(dāng)歸及其主要化學(xué)成分具有抗AS作用[20-23]。本實驗結(jié)果表明，兔皮下注射DL-蛋氨酸12周，模型組血清Hcy水平較正常組明顯升高，表明模型制作成功，腹主動脈病理提示較為明顯的AS征象。當(dāng)歸揮發(fā)油、阿魏酸不僅能降低血清Hcy、TC、TG、LDL-C水平，且能減輕AS病變程度。

綜上，岷當(dāng)歸及其有效成分具有調(diào)節(jié)脂肪代謝紊亂、改善血管內(nèi)皮功能、抗AS的作用。岷當(dāng)歸的主要提取物成分揮發(fā)油和阿魏酸能減輕高同型半胱氨酸血癥對血管內(nèi)皮的損傷，對高同型半胱氨酸血癥致兔AS病變起到防治作用。

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