陳桂芳,劉 艷,,單春喬,馮柳柳,宋 凡,江國托,*

(1.江蘇三儀生物工程有限公司,江蘇 邳州 221300；2.大連三儀動(dòng)物藥品有限公司,遼寧 大連 116036)

丙酸桿菌屬(Propionibacteriumspp.,PB)是厭氧或耐氧的革蘭氏陽性菌,不運(yùn)動(dòng),不產(chǎn)生芽孢,在溫度為30～37℃、pH接近7的環(huán)境中繁殖速度最快[1]。研究表明,丙酸桿菌能夠促進(jìn)雙歧桿菌生長；產(chǎn)生細(xì)菌素等物質(zhì)抑制致病菌的繁殖；利用乳酸產(chǎn)生丙酸,而丙酸作為前體物質(zhì)可以通過糖異生作用生成葡萄糖,為機(jī)體提供能量[2-4]。費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii,PF)是丙酸桿菌的一種,屬于食品級(jí)微生物,我國于2010年將其列入《可用于食品的菌種名單》中[5]。ANGELOPOULOU A等[6]首次將費(fèi)氏丙酸桿菌作為益生菌加入白紋奶酪中制成了益生羊乳酪,同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸和乙酸也能夠促使結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。RYZHKOVA E P等[7]研究發(fā)現(xiàn),費(fèi)氏丙酸桿菌能夠產(chǎn)生抑制細(xì)菌和真菌的多肽類物質(zhì),用于食品的保鮮。杜葳等[8]研究了一種費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)胞離位轉(zhuǎn)化生產(chǎn)維生素B12的方法,使維生素B12的產(chǎn)量達(dá)到108.06 mg/L。ABURJAILE F F等[9]研究發(fā)現(xiàn),費(fèi)氏丙酸桿菌通過降低氧化磷酸化作用、糖酵解和Wood-Werkman循環(huán)等調(diào)節(jié)營養(yǎng)不良患者的新陳代謝活動(dòng)。目前國內(nèi)外對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌的研究主要集中在食品酸奶發(fā)酵劑和其對(duì)人類的益生作用方面,對(duì)其生物學(xué)特性和與別的益生菌間的拮抗作用的研究鮮有報(bào)道。

為了評(píng)價(jià)費(fèi)氏丙酸桿菌的益生菌特性,本研究以費(fèi)氏丙酸桿菌為對(duì)象,采用平板計(jì)數(shù)法研究其抑菌性、耐酸性、耐膽鹽和耐高溫等生物學(xué)特性,并通過平板劃線法研究其與別的益生菌間的拮抗作用,以期為該菌的應(yīng)用提供理論依據(jù),并為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):江蘇三儀生命科學(xué)研究院分離并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

水或乳糖肉湯(saline lactose broth,SLB)培養(yǎng)基:胰蛋白胨1%,酵母粉1%,葡萄糖2%,K2HPO40.025%,MnSO4·H2O 0.005%；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:紹興天恒生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨1%,酵母粉1%,牛肉膏0.5%,K2HPO40.2%,檸檬酸銨0.2%,無水乙酸鈉0.5%,MgSO4·7H2O 0.058%,MnSO4·H2O 0.025%,吐溫-80 0.1%；丁酸梭菌專用培養(yǎng)基:根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]配制；以上培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉即為其固體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。膽鹽:北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉(分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；革蘭氏染液試劑盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

YQX-1型厭氧培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HPX-9272數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái):上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠；GI54DWS立式高壓滅菌鍋:致微(廈門)儀器有限公司；Nikon E100生物顯微鏡:上海尼康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 費(fèi)氏丙酸桿菌的性狀

取適量費(fèi)氏丙酸桿菌菌粉溶解于無菌SLB液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧靜置培養(yǎng)48 h,劃線,37℃厭氧恒溫箱中培養(yǎng)72 h,觀察其菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色。

1.3.2 體外混合培養(yǎng)對(duì)病原菌的抑制作用

[11-12],取培養(yǎng)好的大腸桿菌和費(fèi)氏丙酸桿菌菌液接入SLB液體培養(yǎng)基中,使大腸桿菌和費(fèi)氏丙酸桿菌的初始活菌數(shù)相同,37℃靜置培養(yǎng),于接種培養(yǎng)0、12 h、24 h、36 h和48 h時(shí)分別取樣,對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌和大腸桿菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)為對(duì)照。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的測(cè)定方法同上。

1.3.3 耐酸性試驗(yàn)

將培養(yǎng)48h的費(fèi)氏丙酸桿菌菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接到5 mL新鮮SLB液體培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)至OD600nm=1.0,離心收集菌體,棄掉培養(yǎng)基。將菌體懸浮在pH值為2.0、2.5、3.0的SLB液體培養(yǎng)基中,37℃繼續(xù)培養(yǎng)0、1 h、2 h和3 h后,等比稀釋,涂布SLB平板,活菌計(jì)數(shù),每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,求其平均值。

1.3.4 耐膽鹽試驗(yàn)

方法同耐酸性試驗(yàn),不同之處在于,將菌體懸浮在牛膽鹽含量為0.03%、0.10%、0.20%、0.30%的SLB液體培養(yǎng)基中,37℃繼續(xù)培養(yǎng)0、2 h、4 h和6 h后,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.5 耐高溫試驗(yàn)

參考陳新亮等[13]的方法,并作相應(yīng)修改。取培養(yǎng)48 h的菌株分別于45℃、50℃、55℃、60℃水浴中處理20 min,以不作高溫處理的菌株作為對(duì)照組。進(jìn)行平板計(jì)數(shù),計(jì)算菌株存活率,其計(jì)算公式如下:

1.3.6 與其他益生菌拮抗性試驗(yàn)

參考范利霞[14]的方法進(jìn)行拮抗性試驗(yàn),對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、丁酸梭菌和凝結(jié)芽孢桿菌分別進(jìn)行編號(hào)1、2、3、4、5,其中費(fèi)氏丙酸桿菌用SLB培養(yǎng)基；糞腸球菌和凝結(jié)芽孢桿菌用MRS瓊脂平板；枯草芽孢桿菌用營養(yǎng)瓊脂平板；丁酸梭菌用專用培養(yǎng)基。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用Origin8.0繪圖,SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 費(fèi)氏丙酸桿菌的性狀

由圖1A可知,費(fèi)氏丙酸桿菌是革蘭氏陽性菌,短桿狀,菌落0.2～0.5 mm,圓形,凸面到墊狀,半不透明,閃光,淡黃色。由圖1B可知,在顯微鏡下,費(fèi)氏丙酸桿菌呈短桿狀,細(xì)胞單個(gè)、成對(duì)或短鏈,呈“V”或“Y”字形出現(xiàn),這與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》的描述相一致。

圖1 費(fèi)氏丙酸桿菌的菌落形態(tài)(A)和細(xì)胞形態(tài)(B)Fig.1 Colonial(A)and cell(B)morphology ofP.freudenreichii

2.2 抑菌作用

大多數(shù)益生菌對(duì)致病菌具有較好的抑制作用。費(fèi)氏丙酸桿菌(PF)對(duì)致病菌的抑制作用結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知,當(dāng)與大腸桿菌共培養(yǎng)時(shí),費(fèi)氏丙酸桿菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈對(duì)數(shù)生長,其活菌數(shù)對(duì)數(shù)與對(duì)照組沒有差異性(P＞0.05)；實(shí)驗(yàn)組大腸桿菌在36 h和48 h活菌數(shù)略有降低,但均未達(dá)到1個(gè)數(shù)量級(jí),可見其對(duì)大腸桿菌的抑制作用不明顯(P＞0.05)；由圖2B可知,當(dāng)與沙門氏菌共培養(yǎng)時(shí),費(fèi)氏丙酸桿菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈對(duì)數(shù)生長,其活菌數(shù)對(duì)數(shù)與對(duì)照組沒有差異性(P＞0.05)；實(shí)驗(yàn)組沙門氏菌在12 h和24 h活菌數(shù)對(duì)數(shù)比對(duì)照組略有降低,但是36 h和48 h又與對(duì)照組相同,因此和大腸桿菌相似,費(fèi)氏丙酸桿菌對(duì)沙門氏菌也沒有明顯的抑制作用；由圖2C可知,當(dāng)與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時(shí),費(fèi)氏丙酸桿菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)；從24h開始,實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01),且差異性逐漸增大,在48 h時(shí)活菌數(shù)差異性最大(P＜0.01),達(dá)2個(gè)數(shù)量級(jí),可見費(fèi)氏丙酸桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。

圖2 費(fèi)氏丙酸桿菌對(duì)大腸桿菌(A)、沙門氏菌(B)和金黃色葡萄球菌(C)的抑制作用Fig.2 Results of inhibiting the growth ofEscherichia coil(A),Salmonella(B)andStaphylococcus aureus(C)

2.3 耐酸性試驗(yàn)

益生菌要在胃腸道中保持一定的存活數(shù)量,耐酸性是一個(gè)重要特性。動(dòng)物和人胃液的pH值在3.0左右,而食物在胃中消化的時(shí)間一般為1～2 h[15-16]。對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌的耐酸性進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,隨著pH值下降和時(shí)間上升,費(fèi)氏丙酸桿菌活菌數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),在pH值為2.0的環(huán)境中培養(yǎng)3h,活菌數(shù)降到最低為7.01lg(CFU/mL),活菌數(shù)只下降了一個(gè)數(shù)量級(jí),說明費(fèi)氏丙酸桿菌具有很好的酸耐受性。另外,無論pH為2.0、2.5還是3.0,活菌數(shù)在1h內(nèi)從8.37 lg(CFU/mL)分別降低至7.66、7.72和7.90 lg(CFU/mL),之后的2～3 h仍維持在7.00 lg(CFU/mL),說明費(fèi)氏丙酸桿菌抗逆性強(qiáng),對(duì)酸性環(huán)境表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)能力。費(fèi)氏丙酸桿菌的耐酸性能力類似于乳酸菌,其較強(qiáng)的耐酸能力是在腸道定植生長的關(guān)鍵要素。CAMPANIELLO D等[17]研究發(fā)現(xiàn),費(fèi)氏丙酸桿菌能夠耐受pH=2.5的胃環(huán)境,并在胃腸道中的定植發(fā)揮益生作用,和本研究結(jié)果相似。

圖3 費(fèi)氏丙酸桿菌的耐酸性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of acid tolerance tests ofP.freudenreichii

2.4 耐膽鹽試驗(yàn)

益生菌對(duì)膽鹽的耐受能力是決定其能否在腸道存活、定植并發(fā)揮功效的首要條件之一。菌株本身的特性和膽鹽的濃度是影響其耐受能力的主要因素。腸道中膽鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.30%范圍內(nèi)波動(dòng)[16],因此,通過研究益生菌株在不同濃度膽鹽中的生長情況,可以評(píng)價(jià)該菌株的耐膽鹽能力[18-19]。對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌的膽鹽耐受特性的研究,結(jié)果如圖4所示。

圖4 費(fèi)氏丙酸桿菌的耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of bile salt tolerance tests ofP.freudenreichii

由圖4可知,費(fèi)氏丙酸桿菌在各膽鹽含量中培養(yǎng)6 h,活菌數(shù)都保持在原來的數(shù)量級(jí),可見費(fèi)氏丙酸桿菌具有較強(qiáng)的膽鹽耐受活性,可以順利通過小腸。在膽鹽含量為0.03%的環(huán)境中,菌株對(duì)膽鹽的耐受性最強(qiáng),在該膽鹽含量環(huán)境中培養(yǎng)6h菌株存活率為36.47%。而在0.10%、0.20%和0.30%的膽鹽含量壞境中,培養(yǎng)6h后存活率分別為32.09%、23.97%和18.67%。

2.5 耐高溫試驗(yàn)

益生菌制劑是活菌制劑,對(duì)溫度、壓力、pH值等外界環(huán)境較敏感,這將促使在飼料制粒過程的高溫高壓條件下其活性受到一定的損失,嚴(yán)重影響使用效果[20]。因此耐高溫活性強(qiáng)的益生菌能夠提高在飼料加工過程中存活率。溫度對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌的影響結(jié)果如表1所示。由表1可知,45℃處理20 min,存活率為53.6%；溫度上升至55℃時(shí),費(fèi)氏丙酸桿菌活菌數(shù)下降達(dá)到一個(gè)數(shù)量級(jí),存活率變?yōu)?0.6%；溫度繼續(xù)上升為60℃時(shí),存活率下降至12%,這說明費(fèi)氏丙酸桿菌對(duì)溫度有一定的耐受能力,但耐受力低于芽孢桿菌和一些乳酸菌[21],該結(jié)果為費(fèi)氏丙酸桿菌后期的包被材料和干燥方式的選擇提供了參考依據(jù)。

表1 費(fèi)氏丙酸桿菌的耐高溫試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of high-temperature tolerance tests ofP.freudenreichii

2.6 與其他益生菌拮抗性試驗(yàn)

考慮到不同菌株在不同培養(yǎng)基中生長情況不同,選擇分別研究每種菌株在其最適培養(yǎng)基上與其他4株菌的拮抗作用,然后分析菌株之間的作用效果。5株益生菌間的拮抗性試驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。由圖5A可知,費(fèi)氏丙酸桿菌與其他4株菌劃線相交處菌落連續(xù),表明費(fèi)氏丙酸桿菌與其他4株菌無拮抗作用,可見費(fèi)氏丙酸桿菌可以與常用益生菌配伍使用,從而更大程度的發(fā)揮益生菌間的復(fù)合益生效果；由圖5B可知,枯草芽孢桿菌與其他3株菌劃線相交處菌落連續(xù),與丁酸梭菌劃線相交處菌落不連續(xù),表明枯草芽孢桿菌與費(fèi)氏丙酸桿菌、糞腸球菌和凝結(jié)芽孢桿菌無拮抗作用,與丁酸梭菌有拮抗作用；由圖5C可知,糞腸球菌與其他4株菌劃線相交處菌落連續(xù),表明糞腸球菌與其他4株菌無拮抗作用；由圖5D可知,丁酸梭菌同其他3株菌劃線相交處菌落連續(xù),與枯草芽孢桿菌劃線相交處不連續(xù),表明丁酸梭菌與費(fèi)氏丙酸桿菌、糞腸球菌和凝結(jié)芽孢桿菌無拮抗作用,與枯草芽孢桿菌有拮抗作用；由圖5E可知,凝結(jié)芽孢桿菌與其他4株菌劃線相交處菌落連續(xù),表明凝結(jié)芽孢桿菌與其他4株菌無拮抗作用。因此,在益生菌復(fù)配過程中,應(yīng)考慮到丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌間的拮抗作用提高復(fù)合微生態(tài)制劑的益生活性；而其余菌株間沒有拮抗作用,可進(jìn)行配伍獲得更強(qiáng)益生效果的復(fù)合益生菌劑。

圖5 益生菌間的拮抗性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of antagonism tests between probiotics

2.7討論

2.7.1 益生菌耐受性

影響益生菌在腸道內(nèi)定植的主要因素為低酸度和膽汁酸鹽的濃度[22-23]:動(dòng)物和人類胃液pH值通常在3左右,具有很強(qiáng)的殺菌作用,因而具有耐酸能力的益生菌才能在消化道內(nèi)生長繁殖并發(fā)揮作用；而膽汁酸鹽通過分解細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂肪,使細(xì)菌失活,耐膽鹽能力越強(qiáng)的益生菌,其在腸道內(nèi)的存活幾率越大,因此人們需要全面考慮菌株的生物學(xué)特性才能篩選出性狀良好的益生菌種[12,24-25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明費(fèi)氏丙酸桿菌具有一定的耐酸和耐高溫特性以及較強(qiáng)的膽鹽耐受能力。歐洲食品組織認(rèn)定費(fèi)氏丙酸桿菌是不具有耐藥性和毒力因子的安全性菌株[3],因此費(fèi)氏丙酸桿菌可以作為益生菌添加到人類膳食中。結(jié)果還表明費(fèi)氏丙酸桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌具有很好的抑制作用,但是具有抑菌作用的產(chǎn)物類型尚不完全清楚,抑菌機(jī)制亦有待深入研究。

2.7.2 益生菌間拮抗性試驗(yàn)

生物拮抗作用是生物之間的競(jìng)爭性排斥、干擾和抑制等作用[26]。益生菌的生物拮抗作用有兩方面的表現(xiàn):益生菌與致病菌以及益生菌與益生菌的拮抗作用。研究益生菌間的生物拮抗作用是制備復(fù)合微生態(tài)制劑的前提。丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌間有拮抗作用,這說明這兩種益生菌不適合配伍制備復(fù)合微生態(tài)制劑。費(fèi)氏丙酸桿菌與糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和凝結(jié)芽孢桿菌均沒有拮抗作用,可以復(fù)配使用,這為費(fèi)氏丙酸桿菌的工業(yè)化應(yīng)用提供了新方向。當(dāng)然,對(duì)于費(fèi)氏丙酸桿菌具體的益生效果需要通過臨床試驗(yàn)進(jìn)一步來驗(yàn)證。

3 結(jié)論

費(fèi)氏丙酸桿菌在體外共培養(yǎng)時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用(P＜0.01),且具有一定的耐酸性和很強(qiáng)的耐膽鹽活性,在膽鹽含量為0.3%的條件下培養(yǎng)6 h存活率達(dá)18.67%。費(fèi)氏丙酸桿菌對(duì)高溫能力耐受能力較弱,在60℃條件下維持20 min,存活率下降為12.0%。拮抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,費(fèi)氏丙酸桿菌與枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、凝結(jié)芽孢桿菌和丁酸梭菌均沒有拮抗作用。因此,費(fèi)氏丙酸桿菌作為具有益生特性的食品微生物,可以作為微生態(tài)制劑單獨(dú)或者與其他益生菌配伍,應(yīng)用在動(dòng)物和人類健康中。

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