吳樹坤,楊 磊,楊玲麟,余 輝,黃治國*

(1.四川理工學(xué)院 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室,四川 自貢 643000；2.中國沈酒集團,四川 瀘州 646000)

中國白酒以開放式固態(tài)釀造、多菌復(fù)合發(fā)酵的獨特方式,在世界蒸餾酒中獨樹一幟。根據(jù)其不同的釀造工藝及獨特口感主要分為濃、清、米、醬四大香型,在此基礎(chǔ)上又衍生出了許多其他的香型,沉香型白酒是在清、濃、醬三大香型的基礎(chǔ)上創(chuàng)新研發(fā)出的一種新的香型。沉香型白酒生產(chǎn)用曲為高溫大曲,其加入了26種中藥材使沉香型白酒中帶有藥香,將大曲拌入混合糧(高粱、稻殼和母糟)中進行堆積后,再入窖發(fā)酵[1]。獨特的工藝使得沉香型白酒具有清澈透明,清、濃、醬香氣馥郁,沉香怡人、醇厚綿甜、圓潤協(xié)調(diào)、余味爽凈等典型風(fēng)格。

近年來,隨著白酒行業(yè)的發(fā)展,研究人員對白酒釀造過程中的微生物體系研究越來越多,其中芽孢桿菌的功能性被多次報道[2-4],許多芽孢桿菌都具有產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶等能力,且大多數(shù)芽孢桿菌具有很強的環(huán)境適應(yīng)力,這有利于釀造過程中酶系的積累和原料的利用。故分離并應(yīng)用具有優(yōu)良性能的芽孢桿菌具有重要的意義。趙長青等[5]從濃香型酒醅及其大曲中分離得到一株產(chǎn)己酸乙酯較高且產(chǎn)正丙醇較低的蠟質(zhì)芽孢桿菌,其產(chǎn)己酸乙酯的含量達到國標高度優(yōu)級酒的范圍；楊春霞等[6]從牛欄山二鍋頭酒醅中分離得到5株產(chǎn)風(fēng)味較好的芽孢桿菌,其中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)和兩株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)主要代謝的風(fēng)味物質(zhì)為3-羥基-2-丁酮,而短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的主要風(fēng)味物質(zhì)為苯乙醇。目前尚鮮見有關(guān)于沉香型白酒的研究報道,因此研究沉香型白酒的獨特之處具有重要意義。本試驗采用沉香型酒醅為材料,通過對沉香型酒醅中芽孢桿菌的分離篩選,結(jié)合16S rDNA序列分析和固相萃取和氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法對分離得到的芽孢桿菌進行產(chǎn)酶特性、溫度耐受性和產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力進行研究,旨在為沉香型白酒的發(fā)展提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品取自四川省瀘州市某常年生產(chǎn)沉香型白酒的酒廠,取上、下層出窖糟醅且均勻混合,置于冰盒中迅速運回,4℃保存。

干酪素、氯化鈉、可溶性淀粉、碘、異戊醇、0.1 mol/L磷酸鈉(Na3PO4)(均為分析純):成都科龍化工試劑廠；氯仿(分析純):重慶川東化工(集團)有限公司；飽和酚、20%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)、2%十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethylammonium bromide,CTAB)(均為分析純):北京索萊寶科技有限公司；0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Trisbase)(分析純):美國Sigma-Aldrich公司。

可溶性淀粉培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,NaCl 5 g,淀粉2 g,蒸餾水1 L,pH值調(diào)至7.2±0.1,121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 L,pH值調(diào)至7.2±0.1,121℃滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,酪蛋白10 g,瓊脂20 g,NaCl 5 g,KH2PO42 g,溴百里香酚藍0.05 g,蒸餾水1 L,pH值調(diào)至7.4±0.1,121℃滅菌20 min。

玉米粉液體培養(yǎng)基[6]:玉米粉60 g,KH2PO43 g,蔗糖10 g,MgSO4·7 H2O 1.5 g,蒸餾水1 L,自然pH,121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWYR-D2403搖床:上海智城分析儀器制造有限公司；HWS-12恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Lynx6000高速落地離心機:賽默飛世爾科技有限公司；7890B 5977 GC-MS儀:美國Agilent公司；Mini-Subce11水平電泳儀、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng):美國Bio-Rad公司；Precellys24均質(zhì)機:法國Bertin Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中芽孢桿菌的分離

稱取25 g酒醅樣品,將其加入裝有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,置于搖床振蕩30 min,使菌體懸浮。

采用梯度稀釋涂布法分離酒醅中的芽孢桿菌,將菌懸液稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍并分別涂布于平板,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,將所觀察到的不同形態(tài)特征的菌落進行再次劃線純化,從平板中挑取少量單菌落進行革蘭氏染色,并將純化后所得菌種進行斜面保種,放置于4℃。

1.3.2 芽孢桿菌16S rDNA序列分析

(1)芽孢桿菌DNA提取

將不同形態(tài)的單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h,取2 mL培養(yǎng)液于離心管,13000r/min離心10min,去掉上清液,收集菌體沉淀(共2～3次)；向離心管中加入適量玻璃珠和700 μL DNA提取液,吹打振蕩使菌體重懸,加入50 μL 20%SDS,充分混勻后,用勻質(zhì)器進行機械破壁；隨后加入750 μL酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1,V/V),劇烈振蕩1min,靜置5min,13000r/min離心5 min；取上層清液于新的離心管,加入0.6倍體積的異丙醇,室溫下沉淀30min；13000r/min離心15min,棄掉上清液,加入1mL體積分數(shù)為70%的乙醇洗滌沉淀,13000r/min離心5 min后,棄掉上層乙醇溶液(重復(fù)一次)；放置于超凈臺吹風(fēng)20 min,使DNA沉淀吹干,隨后加入100 μL雙蒸水使DNA溶解。

(2)DNA的擴增及PCR產(chǎn)物檢測

將1.3.2(1)所得到的DNA溶液作為擴增模板,采用通用引物27f-1492R進行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增；25 μL反應(yīng)體系:10×Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)2 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板0.3 μL,Taq酶0.5 μL,加雙蒸水至25 μL。擴增程序:94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環(huán)后,72℃延伸10 min。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳,成像對PCR產(chǎn)物進行檢測。

(3)測序結(jié)果分析

將測序結(jié)果與美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫進行比對,選出序列同源性最高的序列,然后用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 溫度耐受性試驗

將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基分裝10 mL至試管,滅菌待用,然后將不同菌株種子液(108CFU/mL)以2%的接種量加入試管,分別放于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃培養(yǎng)24 h,測定其吸光度值(OD600nm)。

1.3.4 產(chǎn)酶特性研究

(1)淀粉酶透明圈的測定

將活化好的菌用三點法點接到可溶性淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,觀察生長狀況,用0.5%的碘液(I2∶KI=1∶2)進行染色。并記錄其中3個透明圈直徑(D)和菌落直徑(d),并計算其平均比值(D/d)。

(2)蛋白酶透明圈的測定

將活化好的菌用三點法點接到酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,觀察生長狀況,并記錄其中3個透明圈直徑(D)和菌落直徑(d),并計算其平均比值(D/d)。

1.3.5 代謝產(chǎn)物分析

從平板上分別挑取一環(huán)菌體接種至100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h,再以2%(108CFU/mL)的接種量接入裝有100 mL玉米粉液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,于37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)40 h。結(jié)束發(fā)酵后,取5 mL玉米發(fā)酵液進行頂空固相微萃取,再用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析其代謝產(chǎn)物。

固相微萃取條件:在頂空瓶中加入5 mL玉米發(fā)酵液和2 gNaCl,55℃預(yù)熱15 min,萃取吸附30 min,GC解吸3 min,用于GC-MS分析。

氣相色譜(GC)條件:DB-WAX毛細管色譜柱(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度230 ℃；分流比100∶1；程序升溫:40℃保持3 min,6℃/min升至180℃,保持3 min,再以10℃/min升至230℃保持5 min；載氣:純度為99.999%氦氣,載氣流速:0.8 mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件:電離方式為電子電離(electron ionization,EI)源,電子能量70 eV,離子源溫度230℃,四極桿溫度150℃,傳輸線溫度230℃,全掃描模式,掃描質(zhì)量范圍25～500 amu,溶劑延遲3 min。

定性分析:質(zhì)譜圖通過與美國Agilent公司提供的美國國家標準技術(shù)研究所(national institute of standards and technology,NIST)標準普庫05a.L進行比對,選擇匹配度均＞800(最大值為1 000)、特征離子進行定性分析[7]。并采用面積歸一化法進行定量分析,根據(jù)某一物質(zhì)的色譜峰面積與總峰面積的比值求出其相對含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用平均值±標準差(xˉ±SD)表示,利用SPSS 20軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,運用Excel 2010進行作圖和建表。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅中芽孢桿菌的分離

根據(jù)菌落形態(tài)差異并結(jié)合聞香法分離得到4株芽孢桿菌,編號為A、B、F、G,其菌落形態(tài)及菌株形態(tài)見圖1。結(jié)果表明,所得的4株菌革蘭氏染色菌呈紫色,即均為革蘭氏陽性菌且通過平板聞香均具有較好的香味。由圖1A可知,菌株A的菌落呈奶白色,菌落表面光滑且濕潤,易挑取；由圖1B可知,菌株B的菌落呈暗紅色,菌落扁平,表面光滑且濕潤,易挑??；由圖1F可知,菌株F的菌落表面干燥且有許多褶皺,菌落中心呈火山狀,不易挑?。挥蓤D1G可知,菌株G的菌落呈淡黃色,菌落扁平粗糙,邊緣隆起。由此可確定分離所得的菌株均是不同的。

圖1 各菌株菌落及細胞形態(tài)Fig.1 Bacterial colony and cell morphology of each strain

2.2 芽孢桿菌16S rDNA序列分析

4株芽孢桿菌16SrDNAPCR擴增的電泳圖如圖2所示,PCR產(chǎn)物片段大約在1 500 bp左右,條帶很亮無明顯拖尾,陰性對照無條帶,說明反應(yīng)體系無污染,故滿足測序要求。

圖2 4株芽孢桿菌16S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rDNA of 4Bacillusstrains

圖3 菌株A、B、F、G 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of strains A,B,F and G

將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行16S rDNA序列同源性比較,選取同源性≥99%的菌株序列,運用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。由圖3可知,菌株A為阿式芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai),菌株B為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),菌株F為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),菌株G為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.3 芽孢桿菌的溫度耐受性試驗

通過在不同溫度條件下對所得菌株A、B、F、G進行培養(yǎng),結(jié)果見圖4。由圖4可知,菌株A、F、G在40℃時都能生長良好,但隨著溫度升高,OD600nm值急劇下降,50℃時,幾乎不生長了。而菌株B卻有所不同,在50℃時,OD600nm值最大,生長的最好。這表明菌株B的耐熱能力較好,具有一定的嗜熱性,在相對高溫的條件下也具有很強的生長能力,耐高溫細菌在白酒釀造中也是重要的優(yōu)勢菌之一。這與吳群等[8-9]關(guān)于地衣芽孢桿菌的耐熱性研究和描述是一致的。

圖4 不同溫度下各芽孢桿菌的生長狀況Fig.4 Growth status ofBacillusstrains under different temperature conditions

2.4 芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性

2.4.1 芽孢桿菌的蛋白酶透明圈試驗結(jié)果

各芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的透明圈如圖5所示,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)在2.2～3.4,其中菌株B的蛋白酶的D/d值最大,達3.4,其次是菌株G,經(jīng)多重比較分析,菌株B和G所產(chǎn)蛋白酶的D/d值顯著高于其他兩株菌(P＜0.05)。從而可以表明,菌株B和G在一定程度上具有較高蛋白酶活力[10]。微生物通過產(chǎn)生蛋白酶水解原料中的蛋白質(zhì),不僅可以攝取營養(yǎng)更利于自身生長,還可以產(chǎn)生使酒體風(fēng)味更豐滿的醇類物質(zhì)[11]。

圖5 各芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶透明圈結(jié)果Fig.5 Translucent circle results of protease produced byBacillusstrains

圖6 不同芽孢桿菌菌株產(chǎn)蛋白酶D/d值比較Fig.6 Comparison of D/d values of protease produced by differentBacillusstrains

2.4.2 芽孢桿菌的淀粉酶透明圈試驗結(jié)果

各芽孢桿菌菌產(chǎn)淀粉酶的透明圈如圖7所示,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)結(jié)果如圖8所示。由圖8可知,透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)在1.8～2.9,其中菌株B的淀粉酶D/d值最大,達2.92,顯著高于其他3株菌(P＜0.05),而菌株F和G淀粉酶D/d值差異不顯著(P＞0.05),但顯著高于菌株A淀粉酶D/d值(P＜0.05)。故菌株B產(chǎn)淀粉酶能力較好。

圖7 各芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶透明圈結(jié)果Fig.7 Translucent circle results of amylase produced by differentBacillusstrains

圖8 不同芽孢桿菌菌株產(chǎn)淀粉酶D/d值比較Fig.8 Comparison of D/d values of amylase produced by differentBacillusstrains

結(jié)合溫度耐受性試驗可見,菌株B不僅在高溫條件下能穩(wěn)定生長,蛋白酶和淀粉酶透明圈D/d值也是最大的,這說明菌株B在釀造過程中具有更好的生長代謝能力且在高溫條件下具有很大的優(yōu)勢。故可推斷菌株B在沉香型酒醅發(fā)酵過程中具有很大積極的作用。

2.5 芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物分析結(jié)果

根據(jù)1.3.5節(jié)的方法對各菌的發(fā)酵液中的風(fēng)味物質(zhì)進行了分析,并與空白培養(yǎng)基相比較,分析了4株芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中的風(fēng)味物質(zhì),總離子流色譜圖見圖9,各風(fēng)味物質(zhì)含量鑒定結(jié)果見表1。

圖9 不同芽孢桿菌菌株發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.9 Total ion chromatograms of flavor compounds in fermentation broth of differentBacillusstrains analysis by GC-MS

表1 不同芽孢桿菌菌株發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results of flavor compounds in fermentation broth of differentBacillusstrains

由圖9及表1可知,4株芽孢桿菌分別一共檢測得到23種物質(zhì),其中主要包括醇類、酸類、酮類和其他化合物。對各菌發(fā)酵產(chǎn)物進行分析發(fā)現(xiàn),3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇是各菌的主要產(chǎn)物,二者之和分別占各菌發(fā)酵液的32.1%、52.7%、58.1%、75.4%,且3-羥基-2-丁酮具有特有奶油香味,是廣泛使用的食用香料,廣泛存在于水果、肉類等許多食品中[12],3-羥基-2-丁酮還是釀造過程中美拉德反應(yīng)的前驅(qū)物質(zhì)和傳統(tǒng)食品發(fā)酵中重要的風(fēng)味物質(zhì)四甲基吡嗪合成的前提物質(zhì),也是中國白酒風(fēng)味中重要的微量成分之一[13]。此外,菌株A較其他3株菌產(chǎn)3-甲基戊酸和異丁酸的能力更強,分別占35.5%和9.6%。菌株B、F產(chǎn)3-甲基丁酸的能力也較強,分別占29%和12%。具有特殊芳香氣味的愈創(chuàng)木酚只在菌株B、F發(fā)酵液中被檢測出來,且菌株F發(fā)酵液中還檢測出了少量的乙酸(0.95%)和具有芳香氣味的甲酸異丙酯(2.043%)；此外,僅在G菌發(fā)酵液中檢測出了少量的濃香型白酒重要的風(fēng)味物質(zhì)丁酸(1.355%)和己酸(0.542%)。這些物質(zhì)均是白酒中重要的風(fēng)味成分,但不同的菌株所產(chǎn)的風(fēng)味物質(zhì)又具有一定的差異性,使得風(fēng)味更加豐富。通過分析檢測出的風(fēng)味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)了吡嗪合成所需的前體物質(zhì)3-羥基-2-丁酮,而吡嗪類物質(zhì)對醬香型白酒風(fēng)味具有重要貢獻；此外,還檢測到了乙酸、丁酸、己酸等有機酸,這些有機酸是合成乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯的重要底物,也是清香型白酒和濃香型白酒的風(fēng)味成分之一。綜合來看,基本符合沉香型白酒清、濃、醬香氣馥郁的風(fēng)味特點。由此可見,沉香型酒醅中篩選所得的產(chǎn)香芽孢桿菌對沉香型白酒獨特風(fēng)味的形成具有非常重要的作用。

3 結(jié)論

沉香型酒醅中分離篩選得到4株產(chǎn)香能力較好的芽孢桿菌,分別鑒定菌株A為阿式芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)、菌株B為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、菌株F為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、菌株G為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。阿式芽孢桿菌能快速高效的溶解難溶性磷[14],且具有較強的抗輻射能力[15],這將會為發(fā)酵環(huán)境提供更多的有效磷,有利于某些微生物生長代謝。而菌株B、F、G都是與產(chǎn)醬香有關(guān)的重要細菌[16-17]。其中菌株B地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)具有較強的耐高溫的能力,在50℃也能穩(wěn)定生長,且其在淀粉酶和蛋白酶試驗中水解圈D/d值均最大；芽孢桿菌屬(Bacillussp.)對環(huán)境的適應(yīng)力極強,廣泛存在于釀造環(huán)境中,是各類酶系的重要產(chǎn)生菌,同時也是酒體風(fēng)味物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌,對白酒的生產(chǎn)和風(fēng)味均有重要作用。

通過對各芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物進行分析,一共檢測得到23種物質(zhì),其中主要包括醇類、酸類、酮類和其他化合物。其中3-羥基-2-丁酮、乙酸、丁酸、己酸等風(fēng)味物質(zhì)的特征可基本體現(xiàn)沉香型白酒清、濃、醬香氣馥郁的風(fēng)味特點。

通過本試驗可說明沉香型酒醅是多菌復(fù)合發(fā)酵并相互作用產(chǎn)生多種具有特殊風(fēng)味物質(zhì)的場所,由于不同菌株產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的不同,使得風(fēng)味物質(zhì)種類更加豐富。將分離篩選出的優(yōu)良產(chǎn)香菌株加入沉香型白酒釀造過程中,對沉香型白酒的風(fēng)味形成及酒質(zhì)的提高都具有重要的指導(dǎo)意義。

[1]沈云丙,賴高淮,沈怡方,等.沉香型大曲及其制曲工藝、沉香型白酒及其生產(chǎn)方法,CN106497736A[P].2017-03-15.

[2]鄧 杰,黃治國,衛(wèi)春會,等.基于高通量測序的濃香型白酒窖池細菌群落結(jié)構(gòu)分析[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(7):50-55.

[3]袁慶云.醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物的功能研究[J].釀酒,2016,43(4):15-20.

[4]陳 漫.濃香型白酒功能曲品控標準及工藝影響因素的研究[D].北京:中國礦業(yè)大學(xué),2016.

[5]趙長青,徐 莎,楊 陽,等.濃香型白酒釀造大曲及糟醅中功能芽孢桿菌的篩選[J].食品工業(yè)科技,2017,38(7):151-155.

[6]楊春霞,廖永紅,劉峻雄,等.牛欄山二鍋頭酒醅中芽孢桿菌分離鑒定及發(fā)酵風(fēng)味分析[J].食品工業(yè)科技,2012,33(9):69-74.

[7]曹長江.孔府家白酒風(fēng)味物質(zhì)研究[D].無錫:江南大學(xué),2014.

[8]吳 群,徐 巖.高溫大曲中地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis CGMCC3963)的耐高溫特征[J].微生物學(xué)報,2012,52(7):910-915.

[9]布坎南,吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊.8版[M].北京:科學(xué)出版社,1984:729-758.

[10]馬桂珍,暴增海,王淑芳,等.高產(chǎn)蛋白酶細菌的分離篩選及其種類鑒定[J].食品科學(xué),2011,32(21):183-187.

[11]沈怡方.我國白酒生產(chǎn)技術(shù)進步的回眸[J].釀酒科技,2002(6):24-28.

[12]韓 麗,趙祥穎,劉建軍.乙偶姻的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用[J].齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,21(4):80-83.

[13]莊名揚.乙偶姻與美拉德反應(yīng)[J].釀酒,2010,37(2):99-100.

[14]王 琰.解磷芽孢桿菌的篩選鑒定及其對玉米促生機理的研究[D].廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[15]馮 瑋,張 蕾,宣慧娟,等.西藏土壤中耐輻射阿氏芽胞桿菌T61的分離和鑒定[J].微生物學(xué)通報,2016,43(3):488-494.

[16]王 婧.醬香大曲中產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)芽孢桿菌的篩選及其應(yīng)用研究[D].貴陽:貴州大學(xué),2016.

[17]張 榮.產(chǎn)醬香功能細菌的篩選及其特征風(fēng)味化合物的研究[D].無錫:江南大學(xué),2009.