林 楊,劉 淼,林 鋒,張宿義,,霍丹群*,陳 飛,楊 艷,李德林,李嘉偉

(1.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院,重慶 400044；2.瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川 瀘州 646000)

早在1876年,LOUIS PASTEUR就報道了酵母能夠絮凝微生物的現(xiàn)象[3]。但直到1976年NAKAMURA等從214株菌株中,篩選出19種具有絮凝能力的微生物,微生物絮凝劑的研究工作才真正開始[4-5]。此后,不少研究者相繼報道了關(guān)于微生物絮凝劑產(chǎn)生菌篩選、絮凝劑產(chǎn)生條件、作用機理以及分離純化等方面的研究工作[6-8]。本文通過介紹微生物絮凝劑的化學(xué)組成、絮凝機理、絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及微生物絮凝劑在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用,對近幾年微生物絮凝劑的研究工作進行總結(jié),展望微生物絮凝劑的發(fā)展方向,以期使微生物絮凝劑能早日商業(yè)化,投入到實際應(yīng)用之中。

1 微生物絮凝劑的化學(xué)組成

微生物絮凝劑種類繁多,組成性質(zhì)各異。不同微生物產(chǎn)生的微生物絮凝劑化學(xué)組成各不相同,主要成分有多糖、蛋白質(zhì)、脂類以及胞外脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)[9]。通過研究微生物絮凝劑化學(xué)組成,有利于闡明絮凝的機理,為改造和修飾微生物絮凝劑,提高絮凝性能提供理論依據(jù)。

1.1 多糖

多糖是微生物絮凝劑的主要成分,分為同多糖和雜多糖。同多糖一般為中性且僅由一種形式的單糖組成,每個糖單元間通過糖苷鍵相連。在微生物絮凝劑中,根據(jù)糖單元和糖苷鍵的不同,可以分為三類,其代表分別為由腸系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等產(chǎn)生的α-D-葡聚糖、由片球菌(Pediococcussp.)或鏈球菌(Streptococcussp.)等產(chǎn)生的β-D-葡聚糖和由唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)等產(chǎn)生的果聚糖[10]。

目前多糖類微生物絮凝劑大多由雜多糖組成[11-14],它是由兩種或兩種以上不同的單糖分子組成的多糖,大多與脂類或蛋白質(zhì)結(jié)合,其理化性質(zhì)主要由糖單元及其糖苷鍵和支鏈決定。如假單胞桿菌(Pseudomonasp.)代謝產(chǎn)生的藻酸鹽,由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸通過β-(1,4)糖苷鍵相連,有助于生物膜的形成[15]。由奧克西托克雷白桿菌(Klebsiella oxytoca)代謝產(chǎn)生的微生物絮凝劑,其主要成分多糖由鼠李糖和半乳糖糖單元通過糖苷鍵連接而成[16]。在絮凝過程中,多糖類微生物絮凝劑本身為大分子,可以通過電性中和或橋聯(lián)作用與污水中的雜質(zhì)顆粒結(jié)合,從而達(dá)到形成絮凝團,沉淀顆粒的作用[17]。

1.2 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)也是微生物絮凝劑的一種重要成分。其相對分子質(zhì)量大約在10～200kDa間,高分子質(zhì)量可為與雜質(zhì)顆粒結(jié)合提供大量的位點[18],如活性污泥里面的凝集素蛋白,主要作用為使微生物聚集和形成絮凝體[19]。除此之外,某些細(xì)菌分泌的酶蛋白作為一種高效的催化劑,可將污水中的有機物分解,從而達(dá)到降低化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)的目的[20]。

1.3 其他物質(zhì)

除了多糖和蛋白質(zhì)外,脂類和胞外DNA等物質(zhì)也廣泛存在于微生物絮凝劑當(dāng)中。脂類在微生物絮凝劑中主要和多糖結(jié)合,形成脂多糖。氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans)代謝產(chǎn)生的鼠李糖脂和毛孢子菌(Trichosporon mycotoxinivorans)產(chǎn)生的脂多糖是微生物絮凝劑的有效成分,可為微生物絮凝劑提供疏水性的表面,促進微生物絮凝劑與一些如高嶺土和木炭微粒等有疏水性表面的分子之間的反應(yīng)[21]。

胞外DNA存在于許多微生物絮凝劑中,金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)產(chǎn)生的生物絮凝劑中,胞外DNA是主要成分。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)產(chǎn)生的微生物絮凝劑中,也發(fā)現(xiàn)了有少量的胞外DNA的存在[22]。據(jù)文獻報道[23],胞外DNA可以使細(xì)胞聚集。MOSCOSO M等[24]將DNase I加入到肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)該菌生長并未受到影響,但生物膜形成卻受到了很大的影響,說明胞外DNA在生物膜的形成中發(fā)揮重要作用。

2 微生物絮凝劑的絮凝機理

絮凝劑的絮凝機理是一個復(fù)雜的物理化學(xué)過程,傳統(tǒng)化學(xué)絮凝劑經(jīng)典絮凝作用機理主要有雙電層壓縮作用、橋聯(lián)作用、卷掃作用等。對于微生物絮凝劑來說,其種類眾多,絮凝劑的組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜,對于同一個作用體系,不同微生物絮凝劑的作用機理也不同。因此,研究人員提出了許多絮凝機理假說,主要有Butterfield的黏質(zhì)假說、Grabtree的利用PHB(polyhy-β-droxybutyric acid)酯合學(xué)說、Friedman的菌體外纖維纖絲學(xué)說、茄膜學(xué)說、電性中和學(xué)說以及胞外聚合物橋聯(lián)學(xué)說。其中,目前被學(xué)界廣泛認(rèn)可的為橋聯(lián)學(xué)說、電性中和學(xué)說[25]。ALJUBOORI A H R等[26]發(fā)現(xiàn)由黃曲霉(Aspergillus flavusc)合成的微生物絮凝劑IH-7主要絮凝機理為電性中和,即在沒有陽離子助凝劑存在的情況下,帶正電荷的IH-7能打破負(fù)電荷微粒間的平衡,從而使微粒迅速聚集。HE J等[27]通過將鹽單胞菌(Halomonassp.)產(chǎn)生的微生物絮凝劑HBF-3絮凝高嶺土?xí)r發(fā)現(xiàn)橋聯(lián)作用為其主要絮凝機理,即助凝劑CaCl2在微生物絮凝劑與高嶺土之間起到了一個介導(dǎo)橋梁的作用,二價的Ca2+減小了微生物絮凝劑與高嶺土之間的靜電斥力,并縮短了它們之間的距離,使高嶺土與絮凝劑的吸附位點結(jié)合。關(guān)于部分微生物絮凝劑絮凝機理的研究見表1。

確定分型面各位置的大致原則，務(wù)必保證塑件的各種性能、能更好的使塑件脫模和簡化成形模具的結(jié)構(gòu)，分型面同時會受到多種塑件在模具中的位置、灌注系統(tǒng)的制定、成件的結(jié)構(gòu)性能及精度、嵌件的位置外形大小和推出的方案、模具成形的設(shè)計、排氣、實施工藝等許多因素的協(xié)同作用，所以在挑選分型面時應(yīng)該全面的分析和比較，通常可以根據(jù)以下幾點進行篩選。

表1 微生物絮凝劑絮凝機理的研究Table 1 Research on flocculation mechanism of microbial flocculants

3 絮凝劑產(chǎn)生菌株的篩選以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

3.1 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選

具有分泌微生物絮凝劑能力的微生物統(tǒng)稱為微生物絮凝劑產(chǎn)生菌,廣泛分布于活性污泥、土壤、深海。CHEN H G等[39]從含酚的污泥中篩選出了一株嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),它可利用苯酚作為碳源,合成一種名為MBF-06的微生物絮凝劑。OKAIYETOK等[40]從海洋沉淀樣本中篩選出能代謝出微生物絮凝劑REG-6的東洋芽孢肝菌(Bacillus toyonensis)。迄今為止,研究人員已發(fā)現(xiàn)17個種類的微生物具有產(chǎn)生微生物絮凝劑的能力,其中有霉菌、細(xì)菌、放線菌、酵母等[41],但對它們的研究大部分還僅限于篩選和培養(yǎng)階段,未見大規(guī)模工業(yè)利用。關(guān)于產(chǎn)絮微生物及其篩選樣本的研究見表2。

表2 絮凝劑生產(chǎn)菌株及其來源Table 2 Flocculant-producing strains and their sources

3.2 生物絮凝劑產(chǎn)生菌培養(yǎng)的影響因素

微生物的生長需要適宜的環(huán)境,環(huán)境的好壞直接影響了其代謝產(chǎn)物的合成。影響微生物生長和代謝的因素有很多,其中主要有培養(yǎng)基的碳源、氮源、碳氮比、初始pH、培養(yǎng)溫度等。為了提高絮凝劑的產(chǎn)量與活性,必須對這些因素進行優(yōu)化。

3.2.1 碳源、氮源以及碳氮比對微生物絮凝劑產(chǎn)量的影響

一般來說,營養(yǎng)越豐富的培養(yǎng)基越有利于微生物絮凝劑的產(chǎn)生,但不同產(chǎn)微生物絮凝劑菌株對碳源、氮源的要求差別大。常用的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、乙醇等；常用的氮源有蛋白胨、尿素以及各種銨鹽。有些碳源氮源可以促進微生物絮凝劑的產(chǎn)生,有些則會限制微生物絮凝劑的產(chǎn)量。如ALJUBOORI A H R等[52]發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用蔗糖作為碳源時,黃曲霉(Aspergillus flavus)的微生物絮凝劑產(chǎn)量最高,而將果糖、甘油作為碳源時,A.flavus的微生物絮凝劑產(chǎn)量卻大大降低。LIU W J等[53]發(fā)現(xiàn)使用有機氮作為金黃桿菌(Chryseobacterium daeguense)W6產(chǎn)微生物絮凝劑氮源時,所得的微生物絮凝劑產(chǎn)量要明顯高于無機氮。針對目前微生物絮凝劑生產(chǎn)成本高的缺點,ZHAO J等[54]利用含甲醛的污水作為碳源生產(chǎn)微生物絮凝劑MBF-79,在最適條件下,MBF-79的最大產(chǎn)量為8.97 g/L。LIU W J等[55]使用小麥稈、玉米棒等作為碳源生產(chǎn)微生物絮凝劑MBF-L804,實驗結(jié)果表明,MBF-L804的產(chǎn)量為4.75 g/L。

對于微生物絮凝劑的生產(chǎn),碳氮比至關(guān)重要。這是因為合適的碳氮比可以使微生物按比例均勻地吸收營養(yǎng)物,減少環(huán)境酸堿度的波動。研究表明,對于不同種類的微生物,最優(yōu)碳氮比是不同的,沒有定值[56]。LILX等[57]的研究表明,當(dāng)使用放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)F2和球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)F6作為生物絮凝產(chǎn)生菌時,其最佳碳氮比為20。LIU C等[58]發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)微生物絮凝劑MBF-C9的最佳碳氮比為1,其值過高或過低都會影響微生物絮凝劑的產(chǎn)量。除此之外,研究者還發(fā)現(xiàn)碳氮比的不同對微生物絮凝劑的組成也有影響,YE F X等[59]使用活性污泥混菌培養(yǎng)產(chǎn)絮菌株,最佳碳氮比為20,低于此值時微生物絮凝劑里的糖含量減少、蛋白質(zhì)含量增加,而高于此值時微生物絮凝劑里糖含量增加、蛋白質(zhì)含量減少。

3.2.2 pH對微生物絮凝劑產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基的初始pH對微生物絮凝劑的產(chǎn)量有較大影響。對于不同的微生物,其最適初始pH不同。研究者一般通過將同一種微生物在不同的pH條件下培養(yǎng)來探究最適產(chǎn)絮pH。GIRI S S等[60]研究表明,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)F9產(chǎn)微生物絮凝劑的最適pH值為7,在該pH值條件下,微生物絮凝劑的產(chǎn)量為2.32 g/L。CHEN H G等[28]發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)產(chǎn)微生物絮凝劑的最適pH值為6。TIWARI O N等[61]發(fā)現(xiàn)念珠藻(Nostocsp.)BTA97和魚腥藻(Anabaenasp.)BTA990生產(chǎn)微生物絮凝劑的最適pH值為8。LEE J W等[62]的研究表明芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)在酸性條件能代謝微生物絮凝劑。

3.2.3 溫度對微生物絮凝劑產(chǎn)量的影響

溫度是影響微生物絮凝劑產(chǎn)量的又一重要因素。培養(yǎng)基溫度的變化會影響微生物的生長,從而影響微生物絮凝劑的代謝合成。根據(jù)文獻報道[63],大多數(shù)微生物在30～35℃之間微生物絮凝劑產(chǎn)量最高。如黑曲霉(Aspergillus niger)產(chǎn)微生物絮凝劑的最適溫度為35℃[64]。對于某一種微生物,其最適生長溫度和產(chǎn)微生物絮凝劑代謝溫度可能相同,但也可能不同。這可能是因為催化微生物生長途徑和產(chǎn)微生物絮凝劑途徑的酶的最適溫度不同[65]。因此,找到一個合適的溫度有利于微生物生長和微生物絮凝劑合成。

4 微生物絮凝劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用

微生物絮凝劑具有安全、無毒等特性,應(yīng)用于食品工業(yè)中可大大提高污水副產(chǎn)物回收利用的安全性,如酒廠廢水的副產(chǎn)物中的污泥可應(yīng)用于生產(chǎn)人工窖泥,食品廠生產(chǎn)廢水處理副產(chǎn)物可用作肥料[66]。GONG W X等[67]利用無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)產(chǎn)生的微生物絮凝劑處理酒廠、肉加工廠以及醬油廠所排放的廢水,結(jié)果表明,對于酒廠、肉加工廠以及醬油廠所排放的廢水,該微生物絮凝劑化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)去除率分別為80.7%、76.3%和64.1%。PU S Y等[68]采用一種由根霉菌(Rhizopussp.)M9和根霉菌(Rhizopussp.)M17產(chǎn)生的微生物絮凝劑MBF917處理馬鈴薯淀粉廢水,COD和濁度的去除率分別為54.09%和92.11%。陳燁等[69]將微生物絮凝劑處理啤酒廠廢水,結(jié)果表明,廢水懸浮物、生物需氧量(biochemical oxygen demand,BOD)、COD的去除率分別為93.59%、77.40%、70.52%,LUO Y等[70]將微生物絮凝劑與聚丙烯酰胺復(fù)配之后處理蔗糖混合汁,澄清效果要明顯優(yōu)于單獨使用聚丙烯酰胺的效果。除此之外,微生物絮凝劑還廣泛應(yīng)用于發(fā)酵制品的固液分離、發(fā)酵液中培養(yǎng)基殘余菌體的去除等領(lǐng)域[71]。

5 結(jié)論與展望

作為一種安全、可降解的絮凝劑,微生物絮凝劑受到了廣泛的關(guān)注。近年來,生物技術(shù)不斷發(fā)展,新的技術(shù)也不斷用于微生物絮凝劑的研究,微生物絮凝劑的發(fā)展已進入一個新的歷史階段。目前研究可以看出,微生物絮凝劑主要組成成分為多糖和蛋白質(zhì),脂類和胞外DNA等物質(zhì)也在生物絮凝劑中發(fā)揮了重要的作用。相對于其他學(xué)說,橋聯(lián)和電性中和學(xué)說是目前國內(nèi)外較為普遍接受的微生物絮凝劑絮凝機理學(xué)說。但目前來說,對于微生物絮凝劑絮凝機理的研究還不充分,研究工作主要還是通過zeta電位儀進行,希望未來有更先進的儀器用于微生物絮凝劑絮凝機理的研究。微生物絮凝劑產(chǎn)生菌主要分為四類:細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母等,它們廣泛分布于性污泥、土壤、深海等地方,目前大多數(shù)產(chǎn)絮凝菌株也是從這些地方篩選而來的。影響生物絮凝劑產(chǎn)量的主要因素包括:碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)基初始pH以及培養(yǎng)溫度,通過單因素或響應(yīng)面的方法對這些因素進行優(yōu)化,可進一步提高生物絮凝劑的產(chǎn)量。

雖然微生物絮凝劑有諸多優(yōu)點,但其產(chǎn)量小,生產(chǎn)成本高,對絮凝條件要求較高,在極端的環(huán)境中容易失活。因此,目前提高產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本,研究微生物絮凝劑絮凝特性成為其商品化的關(guān)鍵所在。今后微生物絮凝劑的重點研究方向主要有以下幾個方面:

(1)繼續(xù)深入的研究微生物絮凝劑合成的代謝機制、絮凝機理、影響絮凝劑活性的因素,深化微生物絮凝劑的基礎(chǔ)理論研究。在此基礎(chǔ)上,對微生物絮凝劑進行結(jié)構(gòu)改造,如氨基酸修飾的殼聚糖,將色氨酸和酪氨酸與殼聚糖相連[72],進而提高微生物絮凝劑的絮凝效率。

(2)產(chǎn)絮凝劑微生物的培養(yǎng)基原材料價格昂貴,應(yīng)繼續(xù)尋找更為廉價的碳源、氮源,探索更為合適產(chǎn)絮菌株培養(yǎng)條件以降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本,為早日實現(xiàn)微生物絮凝劑的商品化奠定基礎(chǔ)。

(3)將新的現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于微生物絮凝劑的研究,如運用原生質(zhì)體融合和基因工程技術(shù)創(chuàng)造出新的高產(chǎn)絮凝劑菌株。同時,運用代謝工程技術(shù)研究微生物絮凝劑的代謝調(diào)節(jié)機制,進而提高微生物絮凝劑產(chǎn)量。

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