常海斌+侯占銘

摘要：現(xiàn)今世界上最熱門的科學(xué)課題之一是生物體的基因功能研究?；蚯贸╣ene knockout）技術(shù)是研究基因功能最直接有效的一種遺傳功能技術(shù)。該技術(shù)是科學(xué)家通過一定的方法使生物體內(nèi)特定的基因缺失或失活的一種高科技技術(shù)。改變生物體的遺傳基因，令特定的基因功能喪失，從而使部分功能被屏蔽，觀察對生物體造成的影響，進(jìn)而推測出這些基因的生物學(xué)功能?；蚯贸夹g(shù)主要是使用DNA同源重組原理，隨著科學(xué)的進(jìn)步和基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組以外，許多新的原理和技術(shù)也逐漸被采用，例如現(xiàn)今比較成功的基因敲除方法還有ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas技術(shù)等。筆者對基因敲除技術(shù)基本原理和其在各個(gè)方面的應(yīng)用做了簡要的介紹。

關(guān)鍵詞：基因敲除；基因功能；ZFNs；TALENs；CRISPR/Cas

基因敲除技術(shù)在20世紀(jì)80年代后期快速發(fā)展，該技術(shù)是建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上的新型分子生物學(xué)技術(shù)。條件型基因敲除與完全基因敲除是基因敲除的兩個(gè)分支。條件基因敲除是使靶基因在特定的發(fā)育階段或細(xì)胞類型中完全喪失功能的科學(xué)技術(shù)。完全基因敲除是運(yùn)用同源重組的方法徹底去除細(xì)胞中靶基因的活性，這種方法比較簡單。美國遺傳學(xué)家Mario R.Capecchi和Oliver Smithies以及英國遺傳學(xué)家Martin J.Evans被授予2007年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，以此來嘉獎(jiǎng)三位科學(xué)家在利用胚胎干細(xì)胞對小鼠進(jìn)行特性基因修飾技術(shù)時(shí)的重大突破。為了提高基因敲除的特異性和效率，科學(xué)家們不斷創(chuàng)新研究，發(fā)現(xiàn)了諸如ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas等許多基因高效靶向修飾和調(diào)控技術(shù)。這些在世界上新興起的基因敲除技術(shù)為科研工作者對基因功能的研究提供了新的方法，使生命科學(xué)技術(shù)又向前邁進(jìn)了一大步。

一、 基因敲除技術(shù)的主要方法

（一） 利用隨機(jī)插入突變的方法

該方法的優(yōu)點(diǎn)是敲除效率較高、可以使基因徹底失去活性及方便分離鑒別。從分類上來講，隨機(jī)插入突變可劃分為轉(zhuǎn)座子插入突變與TDNA插入突變。轉(zhuǎn)座子插入突變僅適用于存在內(nèi)源活性轉(zhuǎn)位子的植物，但在實(shí)際中此類植物并不是很多。使用根癌農(nóng)桿菌TDNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是TDNA插入失活技術(shù)的基本原理，即在基因組DNA上將一段擁有報(bào)告基因的DNA序列整合，這樣產(chǎn)生的插入突變在植物基因組DNA中很穩(wěn)定，插入位點(diǎn)的隨機(jī)性也較強(qiáng)，但是植物只有容易被TDNA轉(zhuǎn)化時(shí)此法才適用，而且易于產(chǎn)生染色體重排現(xiàn)象，使實(shí)驗(yàn)后續(xù)的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)變得艱難?，F(xiàn)今該方法在擬南芥的研究中使用的較多。

（二） 利用同源重組的方法

使用DNA同源重組原理，用預(yù)先設(shè)計(jì)的同源片段代替靶基因片段，在受體細(xì)胞基因組與外源DNA中，發(fā)生同源重組的是序列一致或者相仿的基因，導(dǎo)致替換受體細(xì)胞基因組里的一致或相仿的序列，整合至受體細(xì)胞的基因組里。以此達(dá)到基因敲除的目的。該技術(shù)專一性強(qiáng)、整合位點(diǎn)精確，可以將外源基因?qū)牖蚪MDNA的特定片段并使其穩(wěn)定遺傳。但是該方法的缺點(diǎn)是極其依靠細(xì)胞里自然出現(xiàn)的同源染色體隨機(jī)互換，不過在自然情況下重組效率極低，并且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，需要很大的工作量才可以完成實(shí)驗(yàn)操作，況且單一地使用同源重組是無法永久修復(fù)人類基因組。

現(xiàn)今經(jīng)過科學(xué)家的不斷探索，人工核酸內(nèi)切酶（Engineered endonuclease，EEN）技術(shù)的誕生令基因敲除更加容易，基因編輯的準(zhǔn)確性與高效性以及實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性都得到了大幅提高。EEN在特異性核酸序列介導(dǎo)下，對特異性DNA位點(diǎn)剪切的是核酸內(nèi)切酶，形成雙鏈斷裂切口（double strand breaks，DSB），然后啟動(dòng)機(jī)體的DNA自我修復(fù)機(jī)制，對已經(jīng)斷裂的雙鏈核酸進(jìn)行修復(fù)。DSB修復(fù)機(jī)制包括非同源末端重組和同源重組兩種形式。非同源末端重組是在對DSB末端簡單加工后的直接連接，連接過程極易發(fā)生堿基的丟失和錯(cuò)配，最終結(jié)果是造成基因功能的喪失并實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除。精確的基因靶向修飾技術(shù)能探索基因的功能，這對于了解病癥的發(fā)生機(jī)制并確定治療手段具有指導(dǎo)性意義。在多細(xì)胞生物尤其是在植物中，DSB的修復(fù)途徑以非同源末端重組為主?，F(xiàn)今在科學(xué)研究應(yīng)用得較多的三種EEN主要有ZFNs和TALENs技術(shù)以及CRISPR/Cas系統(tǒng)。

（三） ZFNs

每個(gè)鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）單體在結(jié)構(gòu)上都是由鋅指蛋白（zincfinger protein，ZFP）和非特異核酸酶結(jié)合的人工合成酶。該酶N端部分可識(shí)別含有特定DNA序列的鋅指蛋白，C端部分由非特異性切割結(jié)構(gòu)域Fok I及連接DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和內(nèi)切酶的肽段構(gòu)成。ZFNs是將特異性識(shí)別模塊和功能模塊這2個(gè)有特定功能的結(jié)構(gòu)域融合，達(dá)到形成具有特殊功能蛋白的目的。在ZFP結(jié)構(gòu)域當(dāng)中，最經(jīng)典的結(jié)構(gòu)類型是Cys2His2。ZFP結(jié)構(gòu)域可以對核苷酸三聯(lián)體進(jìn)行特異性識(shí)別，因此將不同ZFP結(jié)構(gòu)域有序地結(jié)合在一起，便可完成對一段核苷酸序列的靶向結(jié)合。

Fok I的C端的96個(gè)氨基酸殘基可以組成DNA剪切域，而與鋅指蛋白相連的非特異性核酸內(nèi)切酶便來自于此，所以識(shí)別特定位點(diǎn)時(shí)是一個(gè)鋅指蛋白組和Fok I單體連接形成一個(gè)ZFN。有活性的Fok I核酸內(nèi)切酶是以二聚體形式存在的，因此ZFN也應(yīng)以二聚體的形式發(fā)揮功能。2個(gè)單體ZFN在兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)距離6～8bp時(shí)會(huì)相互作用產(chǎn)生酶切功能。1個(gè)DNA雙鏈切口便在這個(gè)特異位點(diǎn)當(dāng)中產(chǎn)生了，接下來進(jìn)行切口修復(fù)的機(jī)制便是細(xì)胞的同源重組或非同源末端修復(fù)，便可達(dá)到定點(diǎn)精準(zhǔn)修飾的目標(biāo)。ZFN的特異性取決于鋅指蛋白，所以篩選高質(zhì)量的鋅指蛋白才可以獲得高效且有特異性的ZFN。

ZFNs是最早被廣泛使用的基因組編輯技術(shù)，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)平臺(tái)很完善，可利用資源豐富，可針對特定序列設(shè)計(jì)ZFN以實(shí)現(xiàn)對靶基因的修飾。ZFNs可以精確地修飾基因以及其周圍的調(diào)控元件，ZFNs技術(shù)極大地提高了基因敲除的效率，許多研究人類疾病的動(dòng)物模型便是由該技術(shù)構(gòu)建。但是ZFNs技術(shù)制備成本較高；而且脫靶率高，會(huì)導(dǎo)致切割基因組非特性序列，造成未知突變，導(dǎo)致后期鑒定工作量的增加；對目標(biāo)DNA序列及其上下游序列依賴性高，因此設(shè)計(jì)高親和性的ZFNs比較難；FNs在細(xì)胞中的表達(dá)最終還會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這些局限性在很大程度上降低了ZFNs設(shè)計(jì)與篩選的效率。endprint