張寧 尹美強 譚青青

摘要：分析苦參轉(zhuǎn)錄組中的簡單重復(fù)序列（SSR）位點信息，為開發(fā)分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。利用Fastqc軟件對苦參轉(zhuǎn)錄組測序的原始讀長（reads）進行質(zhì)量評估，再用Trimmomatic軟件對reads質(zhì)量較差的堿基進行過濾，利用Trinity軟件對Trimmomatic處理后的reads進行序列組裝，之后使用基因組裝完整性評估（BUSCO）軟件對轉(zhuǎn)錄組組裝的序列進行質(zhì)量評估，并分析組裝的conting序列的開放閱讀框（open reading frame，簡稱ORF）;利用MicroSAtellite（MISA）軟件對無冗余獨立基因（unigene）進行SSR搜索。利用Trinity軟件最終篩選得到23074條ORF信息;使用MISA軟件從unigenes序列中發(fā)現(xiàn)8 798個SSR位點，分布于7 339條unigene中，總體上unigenes序列中SSR占比為2.16%，SSR位點平均間隔是5.28 bp，其中占比最高的是單核苷重復(fù)基序，為50.53%;其次是出現(xiàn)頻率分別為22.28%、24.73% 的二、三核苷酸?？鄥⑥D(zhuǎn)錄組中SSR類型眾多，出現(xiàn)頻率高，在后續(xù)的苦參遺傳性狀分析，及次生代謝（苦參堿和黃酮等次生代謝產(chǎn)物）途徑等相關(guān)基因定位等方面具有很好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：苦參;轉(zhuǎn)錄組;SSR;位點信息;基因功能;分子標(biāo)記

中圖分類號： R285 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0041-04

苦參（Sophora flavescens Ait.）是豆科槐屬植物，以其干燥根入藥，味苦，性寒，具有清熱除燥濕、殺蟲和利尿等藥效。其主要藥用成分是生物堿類和黃酮類化合物，已從苦參中分離出生物堿類39個，黃酮類122個成分[1]?？鄥⒅鳟a(chǎn)于山西、陜西、河南、河北等地，在醫(yī)學(xué)臨床、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和日用品等中有廣泛的應(yīng)用[2]。氣候的變化和人為過度的采挖造成野生苦參資源數(shù)量急劇減少[3]。因此，保護和利用好野生苦參資源是當(dāng)務(wù)之急，勢在必行。

分子標(biāo)記開發(fā)可對制定合理有效的種質(zhì)資源保護策略提供科學(xué)依據(jù)，但目前還缺乏能夠應(yīng)用于苦參種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因定位等研究的簡便、高效、穩(wěn)定且具有種屬特異性的分子標(biāo)記體系。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）是由核苷酸構(gòu)成的重復(fù)序列，在真核生物和原核生物基因中都有存在。SSR 位點標(biāo)記具有在生物中分布廣泛、重復(fù)類型多樣、出現(xiàn)頻度高等特點[4]，主要應(yīng)用于分子育種優(yōu)良基因定位、生物多樣性分析、遺傳圖譜繪制、突變體單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）位點分析輔助等。傳統(tǒng)尋找基因組中SSR標(biāo)記的方法存在位點開發(fā)成本高、步驟較多、操作繁瑣等問題[5]。轉(zhuǎn)錄組SSR位點開發(fā)具有方便快捷、效率高等特點，且成本低廉。SSR開發(fā)引物能夠直接快速地定位基因信息。隨著苦參研究的深入，目前還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)苦參轉(zhuǎn)錄組SSR開發(fā)的報道。本研究通過分析苦參轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點信息，為苦參遺傳性狀分析、次生代謝（苦參堿和黃酮等次生代謝產(chǎn)物）途徑、分子標(biāo)記輔助育種及苦參遺傳多樣性研究提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

從NCBI（美國國家生物技術(shù)中心）數(shù)據(jù)共享平臺獲得苦參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）獲得苦參葉片RNA-Seq原始測序數(shù)據(jù)，下載編號是SAMD00029896，使用Illumina HiSeq1000對苦參組織進行建庫測序，原始數(shù)據(jù)reads為 90 bp，采取雙端（paired-end sequencing）測序，獲得1.3 GB轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，下載網(wǎng)址是ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov中的DRR031281[6]。

1.2 轉(zhuǎn)錄組的從頭組裝

首先通過Sratoolkit.2.8.2-1將sra格式轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為fastq格式[7];使用Fastqc軟件進行轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估，然后，利用Trimmomatic軟件對fastq格式的序列進行低質(zhì)量去除，leading頭部去掉質(zhì)量低于3的堿基，trailing尾部過濾掉質(zhì)量低于3的堿基，每4個堿基是一個閱讀框，4個連續(xù)堿基的平均質(zhì)量低于15的過濾掉，reads中最小長度小于40序列的過濾掉 [8];隨后，對高質(zhì)量reads采用Trinity 軟件進行從頭（de novo）組裝[9]，最短contig 長度設(shè)置為200 bp（參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)）。篩選每個基因最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigene，最后組裝得到苦參轉(zhuǎn)錄組的全部轉(zhuǎn)錄本（包含可變剪切）。

1.3 苦參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝完整性評估

選取由Trinity軟件組裝的序列，使用BUSCO V 2.0.1軟件進行苦參葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)完整性評價[10]。BUSCO V 2.0.1 軟件依據(jù) Ortho DB 數(shù)據(jù)庫，組成了幾個大的進化分支單拷貝基因集，將轉(zhuǎn)錄本reads拼接結(jié)果與該基因集數(shù)據(jù)進行比較（基因集直接使用 HMMER3與參考數(shù)據(jù)庫比對），依據(jù)比對上的比例、完整性評估拼接結(jié)果的準(zhǔn)確性和完整性。

1.4 ORF預(yù)測

使用Trinity軟件中的TransDecoder LongOrfs工具對unigene進行開放閱讀框（open reading frame，簡稱ORF）預(yù)測，篩選大于100個氨基酸的ORF序列，獲得最佳的ORF區(qū)域，使用Pfam （http：//pfam.xfam.org/）和UniProt（http：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫對預(yù)測結(jié)果進行校正，將比對結(jié)果保留到Pfam和UniProt數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)序列中[11]。

1.5 SSR位點搜索

使用MISA軟件[12]對苦參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)unigene的SSR位點進行定位搜索，查詢定位規(guī)則是三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)至少5次，二堿基重復(fù)不得少于6次，2個SSR位點之間不足100bp則視為復(fù)合型SSR。

1.6 含SSR序列的基因功能注釋及生物堿基因挖掘

通過diamond blastx和diamond blastp分別將苦參中含SSR的8248條unigene序列與uniprot_sprot、Pfam和eggnog、Kegg、基因本體論（gene ontology，簡稱GO）等數(shù)據(jù)庫進行比對，比對參數(shù)e值<10-5，然后利用WEGO（http：//wego.genomics.org.cn/）在線分析工具進行GO功能分類統(tǒng)計，分析含有SSR unigene的功能分布特征;通過與GO庫進行比對后，得到的unigene注釋結(jié)果按照GO數(shù)據(jù)庫的23個類別進行分類統(tǒng)計。通過對WEGO注釋結(jié)果（3個大類）23個子類更深入分析挖掘苦參堿相關(guān)基因，為進一步研究奠定基礎(chǔ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參轉(zhuǎn)錄組de novo 組裝

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載得到的苦參轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)中共包含14 636 096個雙端測序 reads，通過Trimmomatic軟件過濾得到14 578 802 個高質(zhì)量 reads。轉(zhuǎn)錄組 de novo組裝獲得53 179個長度大于200 bp的contigs，拼接獲得的長序列（contigs）平均長度為813 bp，最長的 contig為22 546 bp，N50為1 464 bp;篩選每個基因中最長的轉(zhuǎn)錄本，共得到54 221條unigenes，平均長度為715.87 bp，最長的unigene 為12 122 bp，N50為1 464 bp（表1）。采用TransDecoder軟件中LongOrfs功能進行ORF預(yù)測，篩選獲得大于100個氨基酸的ORF有29 226個contigs;通過UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對獲得15 242條蛋白質(zhì)序列，Pfam數(shù)據(jù)庫比對獲得126 429條蛋白質(zhì)序列;使用TransDecoder最終篩選得到23 074條ORF信息。

contigs 和unigenes的鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）占比都是44. 8%。從序列長度分布看，序列長度分布在1 000～2 899 bp 的序列大約有19.3%，≥2 900 bp的序列只有0.2%，600～999 bp的序列大約有13.6%，700bp 以下占71.4%（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)完整性評估

對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行評估、測序、組裝得到的轉(zhuǎn)錄序列覆蓋所有可能的轉(zhuǎn)錄本。評估轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的大小和完整性。依據(jù)植物直系同源基因數(shù)據(jù)集對苦參的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)完整性進行評估，由表2可知，在由苦參轉(zhuǎn)錄組序列與植物基因組匹配獲得的1440個植物單拷貝直系同源基因中，完全匹配到的直系同源基因（ complete）有1000個，占總BUSCO的69.4%，部分片段匹配對應(yīng)到的單拷貝直系同源基因（ fragment）有171個，占總BUSCO的11.9%;沒有匹配對應(yīng)到的植物單拷貝直系同源基因（missing）有269個，占總BUSCO的18.7%，完全匹配到的單拷貝直系同源基因（complete）有973個，占總BUSCO的67.6%，完全匹配到的多拷貝直系同源基因（complete）有27個，占總BUSCO的1.9%。

2.4 轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點的分布特點

使用 Trinity軟件組裝得到54 221條unigenes，堿基數(shù)為 38 815 308 bp，平均每條unigene長度為715.87 bp;使用 MISA軟件搜索得到8 798個SSR位點，存在于7 339條unigenes轉(zhuǎn)錄組序列中，包括多個 SSR位點的 unigenes序列有1 173條（包含復(fù)合 SSR為551個）占SSR unigenes序列總數(shù)的13.33%。總體上unigenes序列中SSR占比為2.16%，SSR位點平均間隔距離是4 411 bp。其中占比最高的是單核苷重復(fù)基序，占總SSR 的50.53%;其次是出現(xiàn)頻率分別為22.28%、24.73% 的二、三核苷酸。SSR最短平均分布距離是0.99 bp的單核苷酸重復(fù)類型，平均分布距離最長的是1.29 bp的五核苷酸重復(fù)類型。

苦參轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)類型的SSR位點都有多種基元，在考慮堿基互補且包含復(fù)合重復(fù)基元的情況下，重復(fù)類型合計93種，其中六核苷酸38種，五核苷酸22種，四核苷酸類型17種，在篩選的 SSR中單核酸重復(fù)優(yōu)勢基元為A/T，占比最高，為總基元類型的98.18%，其次是二核苷酸重復(fù)類型優(yōu)勢類型基元AG/CT，為65.72%。三核苷酸重復(fù)類型的優(yōu)勢基元是AAG/CTT，占比27.70%;四、五、六核苷酸重復(fù)類型的優(yōu)勢基元分別是AAAG/CTTT、AACAC/GTGTT、AGAGGG/CCCTCT，所占的比例分別是24.17%、11.90%、7.94%（表3）。

2.5 轉(zhuǎn)錄組SSR 基序重復(fù)類型和頻率特征

不同重復(fù)類型苦參轉(zhuǎn)錄組SSR位點分布存在差異（表4）。單核苷酸重復(fù)類型設(shè)置重復(fù)數(shù)≥15次作為SSR位點的識別條件，因此在表中未分析單核苷酸類型。除單核苷酸外，各重復(fù)類型重復(fù)數(shù)在5～11次之間，隨重復(fù)次數(shù)的逐漸增加，頻率逐步降低。除單核苷酸外，5～7 次是主要集中次數(shù)，占SSR類型總數(shù)的大多數(shù)。

2.6 含SSR序列的基因功能注釋及生物堿基因挖掘

為了解含有SSR序列苦參轉(zhuǎn)錄組序列的基因功能，本研究通過與公共蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，得到含有SSR序列的分類信息和功能注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，uniprot_sprot、Pfam、eggnog、Kegg、GO分別注釋到3 094、3 162、3 061、3 138、3 467個基因。

GO注釋將基因功能分為生物進程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）、功能組分（molecular function）大類，其下又分了很多子類，從不同角度對基因的功能進行分類注釋，各類間互相關(guān)聯(lián)。GO注釋可以全面描述苦參中SSR基因和基因產(chǎn)物的屬性。將搜索到含有SSR的unigene序列使用blastx比對到蛋白數(shù)據(jù)庫，取比對分值最高的為序列注釋信息。細(xì)胞組分注釋10312條，生物進程注釋11 200條，功能組分注釋4 376條。將含有SSR序列的3 467條unigene編號后與其對應(yīng)的GO分類號一起導(dǎo)入到GO分類圖形顯示在線分析工具WEGO 軟件中，得到其基因功能分布（圖2）。結(jié)果表明，在3 467條unigene序列中注釋信息獲得23 483個功能注釋，平均1條unigene有6.77個GO注釋。

苦參主要藥用成分是苦參堿和黃酮類物質(zhì)，通過對含有SSR位點的序列進行GO注釋數(shù)據(jù)挖掘，獲得7個生物堿代謝途徑相關(guān)基因，2個黃酮類生物合成過程相關(guān)基因。

3 討論

苦參轉(zhuǎn)錄組 de novo組裝獲得51 606 個長度大于200 bp的contigs，使用uniprot和Pfam蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行ORF比對校正，uniprot比對上15 242條蛋白質(zhì)序列，Pfam數(shù)據(jù)庫校比對上 126 429 條蛋白質(zhì)序列，TransDecoder最終篩選得到 23 074條ORF信息，unigenes序列長度在700 bp 以下的序列

數(shù)大約占總序列數(shù)的70%。BUSCO對轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果：C占比為69.5%，S占比為67.6%，D占比為1.9%，F(xiàn)占比為11.9%，M占比為18.6%，總BUSCOs數(shù)目為1 440條。

苦參轉(zhuǎn)錄組序列通過MISA搜索到8 798個SSR位點，SSR位點的unigenes序列在苦參轉(zhuǎn)組序列中SSR位點占比為2.16%，平均分布距離4 411 bp出現(xiàn)1個SSR。與其他藥用植物比較，高于黨參的0.022%[13]，低于丹參的0.047%[14]，高于西洋參的0.013 3%[15]和人參的0.017 2%[16];與豆科模式植物大豆相比，高于大豆的0.013 5%[17]。表明苦參的SSR位點數(shù)量較為豐富。通過對含有SSR位點序列的注釋進一步分析獲得苦參生物堿相關(guān)代謝基因，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

本研究結(jié)果為苦參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的SSR位點分析提供依據(jù)。本研究對轉(zhuǎn)錄組序列進行了ORF預(yù)測，反映了基因組中基因的編碼區(qū)域，可進一步確定基因位置，省去了SSR引物設(shè)計開發(fā)過程中的克隆和測序步驟，充分利用了生物信息數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有測序數(shù)據(jù)，降低了開發(fā)成本。同時也明確了苦參SSR位點的基本特點，為進一步開發(fā)設(shè)計新的苦參功能基因SSR 標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)?？鄥⒅蠸SR對于苦參基因功能資源的開發(fā)利用、遺傳資源評估、豐富的分子標(biāo)記、種質(zhì)資源改良和比較基因組學(xué)研究都具有重要的價值。

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