杜禮泉

（四川省綿陽(yáng)市豐谷酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川 綿陽(yáng) 621000）

微生物群落是一定區(qū)域內(nèi)或者一定生境中，各種微生物種群之間相互松散結(jié)合而成的一種結(jié)構(gòu)單位[1]。一定的微生物種群組成微生物群落，對(duì)周圍的生態(tài)環(huán)境有一定的需求和反應(yīng)是微生物群落的特性，不同微生物種群在群落中處于不同的地位并具有不同的作用。窖泥中的微生物是在窖池這一特殊環(huán)境中形成的微生物群落。

在濃香型大曲酒生產(chǎn)中，窖泥質(zhì)量的好壞決定著所產(chǎn)酒質(zhì)量的優(yōu)劣，這主要是由于窖池中濃香、窖香和復(fù)雜香氣物質(zhì)的生成量由窖泥中生香功能菌生成這些風(fēng)味物質(zhì)的能力決定[2]。一般來(lái)說(shuō)，窖泥的窖齡越長(zhǎng)，所富集的功能微生物越多，其釀出來(lái)的酒越香醇，而對(duì)于老窖泥中功能微生物的研究一直都是濃香型白酒的一個(gè)重要課題。本文就窖泥微生物群落的研究、窖泥功能菌液微生物群落的研究、窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究的發(fā)展趨勢(shì)3個(gè)方面進(jìn)行綜述，以期為窖泥微生物有效的人工動(dòng)態(tài)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 窖泥微生物群落的研究

利用窖泥發(fā)酵生產(chǎn)濃香型白酒至少有數(shù)百年之久，但窖泥中微生物的研究長(zhǎng)期以來(lái)都處于空白狀態(tài)，直到20世紀(jì)60年代，我國(guó)才開(kāi)始對(duì)窖泥中的微生物展開(kāi)研究，通過(guò)50多年的研究，窖泥微生物群落研究取得了大批科研成果。目前，窖泥微生物的研究技術(shù)主要采用了純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)，現(xiàn)將這兩類技術(shù)在窖泥微生物群落研究中取得的主要成果作一概述。

1.1 微生物純培養(yǎng)技術(shù)在窖泥微生物群落研究中取得的主要成果

在微生物群落研究中，純培養(yǎng)技術(shù)（如平板劃線分離法、稀釋倒平板法、單細(xì)胞分離法、選擇性培養(yǎng)分離法等）已發(fā)展為研究微生物不可或缺的手段。在19世紀(jì)科赫（Koch）首次建立微生物的純培養(yǎng)技術(shù)后，科研人員已經(jīng)采用純培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)了幾千種細(xì)菌、病毒以及10萬(wàn)種左右的真菌。

在窖泥微生物群落的研究中，采用純培養(yǎng)技術(shù)，從窖泥中分離和鑒定出己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、甲烷氧化菌、硝酸鹽還原菌、硫酸鹽還原菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、丙酸菌等一系列微生物。但是，到目前為止，其中只有少量微生物在濃香型大曲酒中的作用的研究較清楚，在生產(chǎn)中采用人工培養(yǎng)的方式進(jìn)行應(yīng)用的微生物則更少[2]。

窖泥中己酸菌的研究：始于1964年輕工部茅臺(tái)試點(diǎn)組對(duì)濃香型主體香味物質(zhì)己酸乙酯的研究，并成功地從窖泥中篩選出產(chǎn)己酸為主的己酸菌[3]。

窖泥中丁酸菌的研究：在己酸菌的研究基礎(chǔ)上陸續(xù)展開(kāi)窖泥中丁酸菌的研究，內(nèi)蒙輕工所[4]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸菌在窖泥中生成的丁酸是合成己酸的前體物質(zhì)。另外，丁酸菌在新窖泥中對(duì)正丁醇的大量生成還起到重要的作用[5]。

窖泥中甲烷菌的研究：吳衍庸等[6]在1984年研究窖泥微生物群落時(shí)，分離出了甲烷細(xì)菌菌株，并通過(guò)研究窖泥中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，甲烷菌數(shù)量與窖泥質(zhì)量的好壞關(guān)系密切，窖泥中甲烷菌數(shù)量的多少可判斷窖泥是否老熟。甲烷菌可實(shí)現(xiàn)“種間氫轉(zhuǎn)移”關(guān)系，使各種產(chǎn)H2型發(fā)酵得以在窖內(nèi)有效進(jìn)行，且更有利于己酸發(fā)酵，是己酸菌與甲烷菌共棲的作用[6]。

窖泥中放線菌的研究較少：欒興社[7]從窖泥中選出兼性自養(yǎng)型鏈霉菌，并對(duì)其生理生化能力進(jìn)行了較深入的研究。李良等[8]從濃香型夏季窯泥中分離得到1株放線菌。

窖泥中酵母菌的研究方面：倪斌等[9]對(duì)濃香型白酒人工窖泥中的微生物變化進(jìn)行了研究，酵母數(shù)量在釀造過(guò)程中減少。

窖泥中丙酸菌的研究：主要是集中在不同位置窖泥中丙酸菌的含量以及丙酸菌轉(zhuǎn)化乳酸的途徑[4]。

窖泥中不同微生物分布的研究方面：吳衍庸等[10]研究了不同類型微生物在不同窖齡窖池中的分布概況，并發(fā)現(xiàn)了相關(guān)規(guī)律。

1.2 微生物免培養(yǎng)技術(shù)在窖泥微生物群落研究中取得的主要成果

在自然環(huán)境中僅有0.1%～10%的可培養(yǎng)的微生物，因此，采用可培養(yǎng)技術(shù)研究微生物群落的多樣性特點(diǎn)十分困難[11]。不能采用可培養(yǎng)方法培養(yǎng)的微生物叫做未培養(yǎng)的微生物（uncultured microorganisms）。目前，對(duì)未培養(yǎng)微生物的研究主要采用免培養(yǎng)技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlength polymorphism，RFLP）技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)等，且該技術(shù)在窖泥微生物群落的研究中已取得了一系列成果。

黃永光等[12]較早從窖泥中提取微生物的總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）并進(jìn)行研究。

采用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行窖泥微生物多樣性的研究方面：王海英等[13]采用DGGE技術(shù)對(duì)水井坊酒廠窖齡分別為50及150年相同窖池不同部位窖底泥（三點(diǎn)取樣法）進(jìn)行細(xì)菌、古菌和真菌微生物群落特征分析；黃治國(guó)等[14]采用PCR-DGGE技術(shù)探索不同窖齡窖泥細(xì)菌類群及群落演變規(guī)律。

采用PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行窖泥微生物的研究方面：羅惠波等[15]利用該技術(shù)研究認(rèn)為，相同位置窖泥微生物的多樣性指數(shù)與窖齡相關(guān)；同樣，黃治國(guó)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，窖壁上層和窖底窖泥的多樣性指數(shù)隨著窖齡增加而增加，窖壁下層窖泥的多樣性指數(shù)則先降低后再增加。

在以微生物細(xì)胞膜的特征組分磷酸脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）為指標(biāo)研究窖泥方面：鄭佳等[17]研究不同窖齡窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)特征時(shí)發(fā)現(xiàn)，300年窖池的窖泥中直鏈飽和脂肪酸含量最高，真菌PLFA含量在5年窖泥中均高于其他窖齡相應(yīng)樣品，而表征革蘭氏陽(yáng)性（G+）菌、革蘭氏陰性（G-）菌和厭氧菌的PLFA含量高于其他窖齡相應(yīng)樣品的為100年的窖泥。

采用免培養(yǎng)技術(shù)研究窖泥微生物群落的其它主要成果：向文良[18]通過(guò)對(duì)窖泥中原核微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)了窖泥中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，其中，甲烷微菌目和甲烷八疊球菌目為古細(xì)菌主要優(yōu)勢(shì)菌群；李家民等[19]研究發(fā)現(xiàn)，不同窖齡窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)差別不明顯；何翠容等[20-21]采用了FISH技術(shù)研究窖泥微生物群落時(shí)發(fā)現(xiàn)，300年的窖齡的窖泥中細(xì)菌數(shù)量最多，達(dá)到11.19×109cells/g，100年窖齡的窖泥中古菌數(shù)量最高，達(dá)到12.61×109cells/g，古菌數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量最低的為試驗(yàn)窖池的窖泥，其含量分別為0.82×109cells/g、0.78×109cells/g；鄧依等[22]采用指紋圖譜分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在老窖的窖底泥和新窖的窖底泥中，原核微生物多樣性存在著顯著差異；羅青春等[23]采用了熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）法，對(duì)不同窖齡窖泥中甲烷菌進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷菌屬的Copies數(shù)隨著窖齡的增加呈遞增趨勢(shì)。

2 窖泥功能菌液微生物群落的研究

窖泥作為窖池中微生物的主要載體，往往含有大量對(duì)白酒釀造起關(guān)鍵作用的功能微生物。窖泥中微生物的種類和數(shù)量一般與窖泥的窖齡相關(guān)，窖泥的窖齡越長(zhǎng)，窖泥中微生物的種類就越多，數(shù)量也越多[24]。

傳統(tǒng)濃香型大曲酒的生產(chǎn)，窖泥中的微生物由自然接種、自然馴化而成，自窖泥中的功能菌（甲烷菌、丙酸菌、己酸菌等）的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了很多人工培養(yǎng)窖泥功能菌的研究，其中，窖泥功能菌液的有效研發(fā)并用于生產(chǎn)是一項(xiàng)重要的內(nèi)容[25]。吳衍庸等[6]首次對(duì)甲烷菌的篩選、培養(yǎng)以及應(yīng)用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，甲烷菌、己酸菌混合培養(yǎng)和應(yīng)用對(duì)提高酒體己酸乙酯含量效果很好。鐘雨等[26]在丙酸菌的研究與應(yīng)用方面開(kāi)展了較為有效果的試驗(yàn)，研究表明，丙酸菌在濃香型大曲酒生產(chǎn)中具有“增己降乳”的作用。

1964年輕工部茅臺(tái)試點(diǎn)組從窖泥中篩選出了己酸菌，1975年內(nèi)蒙輕工所在此基礎(chǔ)上，采用純培養(yǎng)方法也從老窖泥中篩選出了己酸菌，同時(shí)，研究了己酸菌的培養(yǎng)方法[4]。在己酸菌的生理代謝研究方面。沈怡方[27]經(jīng)過(guò)一系列試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果培養(yǎng)基中乙酸鈉匱乏時(shí)，則易使丁酸的含量增加，如果在培養(yǎng)基中增加淀粉類碳源時(shí)，則使己酸的含量降低，而使丁酸的含量增加。己酸菌培養(yǎng)的改進(jìn)方面：杜禮泉等[28]改進(jìn)了不銹鋼罐培養(yǎng)和培養(yǎng)基（去掉了鈣類物質(zhì)）[28]；婁虹等[29]采用了固定化方法培養(yǎng)己酸菌；王瑞明等[30]采用絮凝技術(shù)提高了培養(yǎng)液中己酸菌的數(shù)量。杜禮泉等[31]解決了己酸菌培養(yǎng)中變黑、發(fā)臭的問(wèn)題。

在窖泥復(fù)合功能菌培養(yǎng)方面：姚萬(wàn)春等[32]將從優(yōu)質(zhì)老窖泥中分離到的優(yōu)良窖泥功能菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，生產(chǎn)濃香型白酒窖泥功能菌液（簡(jiǎn)稱：液體窖泥），用于培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)人工老窖泥，具有很強(qiáng)的實(shí)用性和較大的技術(shù)參考價(jià)值。姚萬(wàn)春等[33]采用濃香型白酒窖泥功能菌液作為主要菌種培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)人工老窖泥；萬(wàn)聯(lián)[24]將己酸菌、丁酸菌及酵母復(fù)配得到的復(fù)合菌液用于養(yǎng)護(hù)液的制備，并將其運(yùn)用于新窖池的強(qiáng)化；杜禮泉等[4，28，33-35]研制了己酸菌、液體窖泥混合培養(yǎng)液、窖泥復(fù)合功能菌液（調(diào)節(jié)窖泥pH、生成己酸等香味物質(zhì)的功能）和特殊生香功能菌液（生成酒體所需的復(fù)合香味物質(zhì)）。

3 窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究的發(fā)展趨勢(shì)

窖泥質(zhì)量對(duì)白酒質(zhì)量有著極其重要的影響。傳統(tǒng)方法生產(chǎn)濃香型大曲酒，主要依靠窖泥從環(huán)境中自然接種、自然馴化，然后緩慢老熟。要生產(chǎn)優(yōu)級(jí)酒，需要數(shù)十年之久。在優(yōu)質(zhì)白酒需求量突飛猛進(jìn)的今天，采用窖泥自然老熟的方法生產(chǎn)濃香型白酒，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)社會(huì)的發(fā)展，因此，人工培養(yǎng)窖泥功能菌并用于加快窖泥老熟，是現(xiàn)代化企業(yè)所急需的。然而，要人為加快窖泥老熟或?qū)涯嘣谑褂眠^(guò)程中進(jìn)行有效調(diào)控，其實(shí)質(zhì)就是對(duì)窖泥微生物的有效調(diào)控。對(duì)于白酒企業(yè)來(lái)說(shuō)，實(shí)現(xiàn)對(duì)窖泥微生物有效的人工動(dòng)態(tài)調(diào)控，使窖泥較快地向優(yōu)質(zhì)窖泥轉(zhuǎn)變、維護(hù)窖泥質(zhì)量和提高窖泥質(zhì)量，是研究窖泥和窖泥功能菌液微生物群落的重點(diǎn)。結(jié)合白酒行業(yè)對(duì)窖泥及窖泥功能菌液微生物群落的最終目的以及窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究存在問(wèn)題的分析，對(duì)今后窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3.1 理論研究與應(yīng)用研究相結(jié)合

通過(guò)理論研究與應(yīng)用研究相結(jié)合對(duì)窖泥及窖泥功能菌液微生物群落研究。

（1）針對(duì)不同質(zhì)量的窖泥進(jìn)行研究，對(duì)優(yōu)質(zhì)窖泥中起主要作用的微生物進(jìn)行深入研究（如功能菌的鑒定、生理生化功能以及它們的數(shù)量和比例）[36-37]。

（2）起正向作用微生物（如生成有利于酒體口感或?qū)τ幸嫒梭w物質(zhì)的微生物）的調(diào)控：可培養(yǎng)的窖泥功能菌通過(guò)培養(yǎng)窖泥功能菌液的方式加入窖泥中，尚不能純培養(yǎng)的窖泥功能菌則通過(guò)改進(jìn)窖泥培養(yǎng)工藝或生產(chǎn)工藝等方式進(jìn)行調(diào)控。

（3）起反向作用微生物（如生成不利于酒體口感或有害人體物質(zhì)的微生物）的調(diào)控：通過(guò)改進(jìn)窖泥培養(yǎng)工藝或生產(chǎn)工藝等方式進(jìn)行調(diào)控。

3.2 純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合

首先，采用免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)窖泥微生物的種類進(jìn)行鑒定以及數(shù)量（比例）的檢測(cè)，再采用可培養(yǎng)技術(shù)研究不同種類的窖泥微生物在窖泥中的生理生化功能，從而確定其在白酒釀造中的作用、有無(wú)人工培養(yǎng)應(yīng)用的價(jià)值以及人工調(diào)控技術(shù)。目前，黃丹等[38]已經(jīng)在窖泥微生物群落的純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合方面作了初步探索。

3.3 純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)的技術(shù)進(jìn)步

提高微生物在平板上的培養(yǎng)能力。竇敏娜[39]采用原位培養(yǎng)技術(shù)、改進(jìn)培養(yǎng)基等方法，最終獲得了數(shù)種在普通瓊脂平板上無(wú)法培養(yǎng)的菌種。如能通過(guò)研究提高微生物在平板上的培養(yǎng)能力，將盡可能多的微生物轉(zhuǎn)變成可被純培養(yǎng)的微生物，從而確定這些微生物在白酒釀造中的作用，并以窖泥功能菌液的方式對(duì)窖泥進(jìn)行微生物種群的強(qiáng)化。

免培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展極為迅速，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）、磷脂脂肪酸（PLFA）法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random ly amplified poly morphic DNA，RAPD）技術(shù)、擴(kuò)增核糖體基因限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）技術(shù)、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、宏基因組學(xué)技術(shù)等，其中一些技術(shù)在窖泥微生物的研究中已有初步探索。

當(dāng)然，對(duì)于窖泥中不可培養(yǎng)的微生物在研究手段上還有待突破，如PCR-DGGE等通過(guò)提取、鑒定窖泥微生物DNA的技術(shù)，無(wú)法測(cè)定窖泥中微生物數(shù)量；熒光原位雜交（FISH）技術(shù)在研究窖泥微生物時(shí)，可測(cè)定微生物數(shù)量，但其準(zhǔn)確度有待提高，并且，由于核酸探針?lè)N類的限制，在微生物種類鑒定上也存在很大難度。

3.4 其他相關(guān)技術(shù)

BIOLOG微平板技術(shù)在釀酒微生物的研究方面有所探索[40]，在窖泥微生物研究方面值得借鑒。

4 結(jié)束語(yǔ)

窖泥及窖泥功能菌液微生物群落的研究如能在已有成果基礎(chǔ)上，通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)、免培養(yǎng)技術(shù)以及BIOLOG微平板技術(shù)、微生物生物量的研究等方法的應(yīng)用，通過(guò)理論研究與應(yīng)用研究相結(jié)合，有望早日實(shí)現(xiàn)對(duì)窖泥微生物有效的人工動(dòng)態(tài)調(diào)控，達(dá)到窖泥較快地向優(yōu)質(zhì)窖泥轉(zhuǎn)變、維護(hù)和提高窖泥質(zhì)量的目的，從而促進(jìn)濃香型白酒的技術(shù)提升和進(jìn)一步發(fā)展。