鄭偉偉，趙萌，劉波

(齊魯工業(yè)大學 食品科學與工程學院，濟南 250353)

近些年來許多流行病的增加都與糖的攝入有關(guān)，包括肥胖、糖尿病、高血糖癥和齲齒。鑒于此，人們對于安全、健康、天然甜味劑的需求更加迫切。甜味蛋白質(zhì)作為一種新型的甜味化合物，可以作為天然、低熱量的甜味劑。和蔗糖不同，甜味蛋白質(zhì)不會引起體內(nèi)胰島素的變化，因此，它們可能是人工甜味劑、食品和飲料行業(yè)中糖類最合適的替代品[1]。

甜味蛋白質(zhì)通常是從植物中提取的小分子量多肽，它們大多具有超強的甜味，其甜味度約為同摩爾蔗糖甜味的2000～3000倍。目前研究較多的有7種甜味蛋白質(zhì)：Thaumatin，Monellin，Miraculin，Curculin，Mabinlin，Brazzein以及Pentadin。相比化學合成的甜味劑，它們安全無毒；相比其他的天然甜味劑，它們能量低，又因為甜度高和可以被消化降解為人體所需的天然氨基酸受到越來越多科學家的關(guān)注[2]。在這些甜味蛋白質(zhì)中，Brazzein相對分子質(zhì)量最小，僅有6.5 kD，具有良好的耐熱性和耐pH穩(wěn)定性，因此Brazzein有可能成為一類新型的具有發(fā)展?jié)摿Φ奶鹞秳?/p>

1 甜味蛋白Brazzein的來源及生化特性

Brazzein是由Ming和Hellekant從西非熱帶植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果實中分離得到的。Brazzein以2種形式存在：其主要存在形式是在氨基末端有焦谷氨酸，而少量形式在氨基末端缺少焦谷氨酸。甜味感官評價結(jié)果顯示后者的甜度是前者的2倍[3]。

Brazzein 分子是一種小分子量單鏈蛋白，它含有54個氨基酸殘基，在目前發(fā)現(xiàn)的7種植物甜味中Brazzein蛋白相對分子量最小，因此研究者更愿意研究它的結(jié)構(gòu)。

Brazzein具有較好的溶解性，并表現(xiàn)出良好的熱力學穩(wěn)定性和pH 值穩(wěn)定性。Brazzein分子在85 ℃時仍保持折疊形式。人工合成的L-2型Brazzein具有甜味，但是合成的D-2型卻不具有甜味[4]。Caldwell等利用NMR研究了Brazzein的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示Brazzein包含1個短的α螺旋(殘基21～29)和3個反平行的β折疊(strand I，殘基5～7；strand II，殘基44～50；strand III，殘基34～39)，4對二硫鍵將其分子的所有二級結(jié)構(gòu)相交聯(lián)(PDB:2BRZ)。

2 Brazzein甜味的決定因素

2.1 包含Arg43的彈性環(huán)周圍的氨基酸殘基

在其他的甜味蛋白中，對甜味重要的氨基酸殘基都位于彈性環(huán)區(qū)域[6]。Brazzein有1個彈性環(huán)(殘基38～45),包括Phe-Tyr-Asp-Glu-Lys-Arg-Asn-Leu序列。這個環(huán)包含Arg43,該氨基酸殘基是β轉(zhuǎn)角在strand Ⅱ和 strand Ⅲ之間的中心。有研究指出這個氨基酸殘基對于產(chǎn)生甜味是非常必要的[7]。此外，Tyr39, Asp40, Glu41, Lys42和Arg43這些氨基酸殘基的化學修飾，也參與了Brazzein甜味的形成。

2.2 帶電荷的氨基酸殘基

Brazzein極富電荷性和極性，它的序列包括5個天冬氨酸、2個精氨酸、4個谷氨酸、1個組氨酸、7個賴氨酸、6個酪氨酸和2個絲氨酸。這些帶電荷氨基酸殘基大約占總殘基的50%。這些殘基的大多數(shù)都靠近環(huán)或者在N-末端與C-末端區(qū)域。Ming等[8]對這些類型的氨基酸殘基進行了突變，結(jié)果顯示這些帶電荷的氨基酸殘基對于Brazzein的甜味是非常重要的。

Joo-Won Lee等[9]通過定點突變技術(shù)設(shè)計了多個突變體,他們發(fā)現(xiàn)所有的雙突變(H31R/E36D，H31R/E41A和E36D/E41A)甜味均比野生型、單突變的甜。而且他們還發(fā)現(xiàn)三重突變(H31R/E36D/E41A)的甜味明顯比雙突變的甜。這些發(fā)現(xiàn)表明Brazzein可能與甜味受體表面的多個位點結(jié)合。如果減少蛋白質(zhì)表面整體的負電荷或者增加正電荷，就有可能增加Brazzein的甜味。同樣的帶電荷和極性的殘基對于甜味的重要性在甜味蛋白質(zhì)Thaumatin和Monellin中也有報道[10]。

2.3 N-末端和C-末端

N-末端參與Brazzein的甜味。N-末端帶有葡萄球菌核酸酶(SNase)的Brazzein融合蛋白沒有甜味，因此一個體積龐大的N-末端延伸物可能抑制它與受體的相互作用[11]。靈活的C末端是Brazzein與甜味受體作用的主要位點之一，其中C末端的第53位氨基酸對于Brazzein的甜味具有重要作用。該位置氨基酸的大小和側(cè)鏈的電荷可能賦予了它與甜味受體獨特的相互作用[12]。

2.4 其他的因素

Izawa等發(fā)現(xiàn)化學合成的Brazzein的甜味依賴于正確折疊的結(jié)構(gòu)。相似的，Kim S H等也發(fā)現(xiàn)當甜味蛋白質(zhì)Thaumatin和Monellin蛋白沒有折疊時，甜味也沒有了。

對于Brazzein 分子中的半胱氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸的化學修飾,均導(dǎo)致甜味的降低或喪失[13]。Brazzein 的半胱氨酸具有極為重要的結(jié)構(gòu)意義,它們的還原和S烷基化將導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的解體和三級結(jié)構(gòu)的破壞,從而使其喪失甜味活性[14]。

Cornilescu C等[15]發(fā)現(xiàn)低溫形式的Brazzein與人類T1R2甜味受體的胞外區(qū)域的結(jié)合比高溫形式結(jié)合的更緊密。因為Brazzein與溫度有關(guān)的氨基酸涉及多個位點，而這些位點對與異二聚體甜味受體的相互作用或者它的甜味都是很重要的。

3 Brazzein的基因工程

因產(chǎn)Brazzein 的植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon生長條件苛刻, 在原產(chǎn)地之外不能結(jié)實。于是人們便把希望寄托在Brazzein 的基因工程上。迄今為止,Brazzein基因已在數(shù)種微生物、真菌和高等植物表達等方面，都取得了一定進展。近幾年，國內(nèi)在基因工程上主要側(cè)重Brazzein的合成和表達，而國外則側(cè)重Brazzein的突變，以尋求性質(zhì)穩(wěn)定、甜味更好的突變體。

3.1 Brazzein在原核生物中的表達

Brazzein在原核生物中的表達，主要集中在大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌。尤其是在以大腸桿菌作為表達菌的研究中，目的蛋白的產(chǎn)量及生物活性都有了很大提高。

李春麗等[16]于2004 年根據(jù)甜蛋白Brazzein 的成熟區(qū)氨基酸序列，按照大腸桿菌的密碼子偏好性成功構(gòu)建重組表達載體pET-Bra。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后得到了與預(yù)計分子量相同的蛋白，約占細菌可溶性蛋白的12.8%，純化后的重組蛋白的甜度約是同等重量蔗糖的600倍。張詠春等[17]于2009年在Brazzein肽鏈中引入31His -Ala的突變, 依照Bacillussubtilis的偏愛密碼子,合成了定點突變后的Brazzein 編碼序列,并在B.subtilisWB600中實現(xiàn)了可溶性胞內(nèi)表達,得到了表達量較高的活性蛋白產(chǎn)物。王長遠等[18]根據(jù)乳酸乳球菌的密碼子偏好性，對Brazzein 編碼基因進行優(yōu)化和突變，將優(yōu)化后的基因克隆入表達載體，在乳酸乳球菌表面成功構(gòu)建了Brazzein 高水平的表達系統(tǒng)，在乳酸菌表面得到了甜味蛋白。

3.2 Brazzein在真菌中的表達

趙紅玲等[19]于2005 年將含有Brazzein 基因的pPIC9K穿梭質(zhì)粒通過電導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母 GS115中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達后，得到的目的蛋白的分子量與理論值一致，經(jīng)過小規(guī)模的發(fā)酵，目的蛋白的含量可以達到385 mg/L，純化后的目的蛋白可以嘗到微的甜味。史勇等[20]對甜味蛋白Brazzein 基因進行改造，采用重疊PCR合成目的基因并克隆到pMD18T 載體，將構(gòu)建好的重組載體pGAPZαA-Bra用AvrⅡ線性化，電轉(zhuǎn)進入巴斯德畢赤酵母中。通過篩選ZeocinTM陽性克隆菌，進行蛋白表達，SDS-PAGE 結(jié)果表明蛋白表達成功。

3.3 Brazzein在植物中的表達

Tomes 等[21]曾構(gòu)建了Brazzein 基因的植物表達載體，將其在植物中進行表達，但未見確定結(jié)果的報道。蔣迪[22]于2002 年人工合成Brazzein 基因，并對生菜和煙草進行了轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因植株及其種子。郭淑華[23]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行了甜味蛋白Brazzein在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化，并利用反轉(zhuǎn)錄檢測到了Brazzein基因在轉(zhuǎn)基因果實中的轉(zhuǎn)錄表達。王克婧等[24]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行人參果的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化再生植株54 株，經(jīng)檢測從中篩選出15株陽性植株，初步確定目的基因已經(jīng)整合到人參果基因組中。雖然有報道能夠?qū)⒒虻木幋a序列整合到植物基因組中，也在轉(zhuǎn)錄水平檢測到了目的基因的轉(zhuǎn)錄表達，但在蛋白質(zhì)水平上表達還不夠理想，這可能與基因轉(zhuǎn)錄后修飾以及蛋白質(zhì)修飾有關(guān)。

3.4 Brazzein在哺乳動物中的表達

Gordon K等[25]利用轉(zhuǎn)基因的技術(shù)在小鼠的乳腺中獲得β-酪蛋白，這項技術(shù)成功促進了乳腺生物反應(yīng)器相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展。乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的蛋白不僅活性高，無污染，且具有蛋白的天然活性。閻森[26]在小鼠乳汁中成功表達植物甜味蛋白，并生產(chǎn)出具有生物活性的蛋白，對進一步利用大動物如牛、羊等大規(guī)模生產(chǎn)高效活性的甜味蛋白以及利用動物乳腺生物反應(yīng)器表達其他植物蛋白具有非常重要的借鑒意義。安辰瑞等[27]以人工合成的甜味蛋白Brazzein 基因為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了甜味蛋白Brazzein 基因的乳腺特異性表達載體。

4 研究的意義

Brazzein的研究開發(fā)還未成熟, 目前仍處在實驗室階段。但是隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模生產(chǎn)重組甜味蛋白而替代從植物中提取的生產(chǎn)方式，必將促進甜味蛋白質(zhì)具有更廣闊的發(fā)展前景。與傳統(tǒng)的甜味劑相比，Brazzein有許多優(yōu)點。例如作為一種高甜度、低熱值的非糖甜味劑，Brazzein甜味醇厚，口感好，消化后不會引起血糖升高，不會引起齲齒，安全性好，可以用于食品中增進或改善風味。因此，研究并開發(fā)Brazzein具有極其重要的意義，相信在追求健康天然的食品市場中會有巨大的前景。

5 挑戰(zhàn)與前景

甜味蛋白Brazzein最終被廉價地推向食品市場, 必然會面臨許多挑戰(zhàn)。首先，Brazzein是從一種熱帶植物中分離得到的，但是這種熱帶植物在其他的環(huán)境很難結(jié)出果實，從而限制了它的開發(fā)和應(yīng)用,利用化學合成成本又是一個關(guān)鍵性問題；其次就是Brazzein表達過程中所要面臨的技術(shù)難題；迄今為止，Brazzein已在微生物、真菌、植物和哺乳動物中進行了表達，表達產(chǎn)物或者產(chǎn)量低，或者沒有甜味，迄今尚達不到理想的效果；第三，利用基因工程生產(chǎn)的Brazzein最終推向市場還必須經(jīng)過安全檢驗，在審批過程中，首先要對Brazzein進行毒理學檢測，將基因工程生產(chǎn)的Brazzein與天然Brazzein進行廣泛的比較，以確定這兩類蛋白的生物學活性是否完全一致；最后，在工業(yè)生產(chǎn)中甜味蛋白分離純化過程成本的控制也是亟待解決的問題。因此，最終將Brazzein廉價安全地推向市場，還有很長的路要走。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展，克服這些困難也指日可待。Thaumatin在商業(yè)開發(fā)中的成功就是一個例證。相信在不遠的將來，通過科研工作者和食品開發(fā)研究人員的共同努力，甜味蛋白Brazzein一定能夠作為一種高效優(yōu)質(zhì)的甜味劑走向市場，為食品工業(yè)的發(fā)展和人類健康做出更大的貢獻。

[1]Gu W,Xia Q,Yao J,et al.Recombinant expressions of sweet plant protein mabinlin II inEscherichiacoliand food-gradeLactococcuslactis[J].World J Microbiol Biotechnol，2015，31(4):557-567.

[2]張連忠，孫濤，高帥.甜味蛋白Brazzein的研究進展[J].唐山師范學院學報,2007,29(5)：29-32.

[3]Izawa H,Ota M,Kohmura M,et al.Synthesis and characterization of the sweet protein brazzein[J].Biopolymers,1996,39(1):95-101.

[`4]呂振岳,周達民,黃東東.甜味蛋白研究進展[J].生物工程進展,2002,22(1):64.

[5]Caldwell J E,Abildgaard F,D?akula ?,et al.Solution structure of the thermostable sweet-tasting protein brazzein[J].Nature Structural & Molecular Biology,1998,5(6):427-431.

[6]Mizukoshi T,Kohmura M,Suzuki E I,et al.Structure and dynamic studies by NMR of the potent sweet protein monellin and a non-sweet analog[J].Febs Letters,1997,413(3):409-416.

[7]Assadi-Porter F M,Aceti D J,Markley J L,et al.Sweetness determinant sites of brazzein,a small,heat-stable,sweet-tasting protein[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2000,376(2):259-265.

[8]Ding M,Hellekant G,Hu Z.Characterization and chemical modification of brazzein,a high potency thermostable sweet protein fromPentadiplandrabrazzeana[J].Acta Botanica Yunnanica,1995,18(2):123-133.

[9]Joo-Won Lee,Ji-Eun Cha,Hyun-Joo Jo,et al.Multiple mutations of the critical amino acid residues for the sweetness of the sweet-tasting protein,brazzein[J].Food Chemistry,2013,138(2):1370-1373.

[10]Shamil S,Beynon R J.A structure-activity study of thaumatin using pyridoxal 5'-phosphate (PLP) as a probe[J].Chemical Senses,1990,15(4):457-469.

[11]Assadi-porter F M,Aceti D J,Cheng H,et al.Efficient production of recombinant brazzein,a small,heat-stable,sweet-tasting protein of plant origin[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2000,376(2):252-258.

[12]Lim J K,Jang J C,Kong J N,et al.Importance of Glu53 in the C-terminal region of brazzein,a sweet-tasting protein[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2000 ,376(2):252-258.

[13]Kim S H,De VA,Ogata C.Crystal structures of two intensely sweet proteins[J].Trends in Biochemical Sciences,1988,13(1):13-15.

[14]丁鳴,Hellekant G,胡忠.耐熱甜味蛋白Brazzein的特性和化學修飾[J].云南植物研究,1996,18(2):123-133.

[15]Cornilescu C C,Cornilescu G,Rao H,et al.Temperature-dependent conformational change affecting Tyr11 and sweetness loops of brazzein[J].Proteins: Structure,Function,and Bioinformatics,2013,81(6):919-925.

[16]李春麗,何國慶,阮暉,等.des-pGLU1-Brazzein 基因的人工合成及其在大腸桿菌中的重組表達[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2005,13(1):38-41.

[17]張詠春,郝思捷,鄒寅,等.甜味蛋白Brazzein在Escherichiacoli和Bacillussubtilis中的表達研究[J].復(fù)旦學報:自然科學版,2009,48(1):136-141.

[18]王長遠,許鳳,沈冰蕾,等.乳酸乳球菌表面表達Brazzein甜味蛋白系統(tǒng)的建立[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26(8):1170-1173.

[19]趙紅玲,陳勁春.利用畢赤酵母表達植物甜蛋白(Brazzein)的初步研究[J].北京化工大學學報,2005,32(2):14-17.

[20]史勇,張明軍,張英,等.甜味蛋白 Brazzein 基因酵母表達系統(tǒng)的建立[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2010,32(1):43-46.

[21]Witty M.ThaumationⅡ-a palatability protein[J].Trends in Biotechnology,1990,8(5):113-116.

[22]蔣迪.甜蛋白基因Brazzein 在大腸桿菌中的表達及對生菜和煙草的遺傳轉(zhuǎn)化[D].杭州：浙江大學,2002.

[23]郭淑華.甜味蛋白Brazzein 在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院,2005.

[24]王克婧,張金文,張菲菲,等.重組 des-pGlu1-Brazzein 基因植物表達載體的構(gòu)建及對人參果的遺傳轉(zhuǎn)化[J].分子植物育種,2016(6):1470-1481.

[25]Gordon K,Lee E,Vitale J A,et al.Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk[J].Biotechnology,1992,24(11):425.

[26]閆森.植物甜味蛋白在哺乳動物乳腺中的分泌表達[D].長春:吉林大學,2013.

[27]安辰瑞,李詠樂,詹俐楠,等.乳腺特異的甜味蛋白Brazzein基因真核表達載體的構(gòu)建[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(7):29-32.