張瑩瑩，錢(qián)志娟，謝正軍，彭池方,3*

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122;2.揚(yáng)州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 揚(yáng)州 225000;3.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是由曲霉屬的7種曲霉和青霉屬的6種青霉菌產(chǎn)生的一組真菌毒素，包括赭曲霉毒素A(Ochratoxin A ，OTA)、赭曲霉毒素B(Ochratoxin B，OTB)、赭曲霉毒素C(Ochratoxin C，OTC)、赭曲霉毒素α(Ochratoxin α，OTα)，其中OTA的毒性最大、分布最廣、對(duì)農(nóng)產(chǎn)品污染最重、與人類(lèi)健康關(guān)系最為密切[1]。OTA廣泛存在于各種食品和飼料中，如咖啡、酒類(lèi)、堅(jiān)果、谷物等[2]。OTA對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的毒性作用主要是致畸、致癌、致突變、腎臟毒、肝毒以及免疫抑制[3]，國(guó)際癌癥組織(IARC)將其定為2B類(lèi)致癌物[4]。目前，檢測(cè)OTA的方法主要有免疫化學(xué)分析方法[5-6](ELISA)、薄層色譜法[7](TLC)、高效液相色譜法(HPLC)[6,8-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-11]、表面增強(qiáng)拉曼光譜[12-13](SERS)及電化學(xué)檢測(cè)法[14-16]等。這些方法精度好、靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、儀器昂貴、需專(zhuān)業(yè)人員操作、操作復(fù)雜、不便攜帶等不足，不利于實(shí)際應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單方便、成本低、靈敏度高、特異性好的OTA快速檢測(cè)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET) 作為一種均相分析檢測(cè)技術(shù),由于操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、時(shí)間和空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。FRET是指兩個(gè)不同的熒光基團(tuán),其中1個(gè)熒光基團(tuán)作為能量供體(Donor),另1個(gè)作為能量受體(Acceptor),當(dāng)能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的激發(fā)光譜能夠有效重疊,并且二者之間的距離處于1.0～10.0 nm之間,用能量供體的激發(fā)光來(lái)激發(fā)時(shí),會(huì)觀察到供體的能量向受體轉(zhuǎn)移，發(fā)生一種非輻射的能量轉(zhuǎn)移[17]。對(duì)于提高FRET的效率，選擇合適的供體和受體非常關(guān)鍵。相對(duì)于傳統(tǒng)的有機(jī)染料以及半導(dǎo)體量子點(diǎn)等下轉(zhuǎn)換熒光供體，上轉(zhuǎn)換熒光材料(Upconversion nanoparticles,UCNPs)由于優(yōu)異的光化學(xué)特性備受研究者青睞。上轉(zhuǎn)換熒光材料發(fā)光由近紅外光(尤其是980 nm)激發(fā)，在可見(jiàn)光區(qū)發(fā)射[18]，克服了生物組織自體熒光干擾和組織穿透深度不足等問(wèn)題[19]。同時(shí)，UCNPs還具有較高的光穩(wěn)定性及化學(xué)穩(wěn)定性、較低的生物毒性、較大的比表面積、較低的成本[20-21]；并且由于較窄的激發(fā)和發(fā)射光譜以及較大的斯托克斯位移，避免了背景及受體發(fā)光信號(hào)的干擾，提高了檢測(cè)的靈敏度[22]，因此，UCNPs是FRET的理想供體。例如，Wu等[23]利用UCNPs及碳納米粒子之間的FRET效應(yīng)來(lái)檢測(cè)癌胚抗原；Saleh等[24]利用UCNPs及金納米粒子之間的FRET效應(yīng)檢測(cè)了生物素及親和素之間的相互作用；Long等[25]利用UCNPs與金納米粒子之間靜電作用產(chǎn)生的FRET效應(yīng)來(lái)檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥。

在以UCNPs作為能量供體的FRET反應(yīng)中，金納米粒子(AuNPs)由于較高的消光系數(shù)及猝滅效率被廣泛用作能量受體[21,26]。本實(shí)驗(yàn)將UCNPs及AuNPs分別修飾OTA適配體和互補(bǔ)鏈制成能量供體探針及受體探針，利用核酸雜交反應(yīng)拉近兩種材料的空間距離，實(shí)現(xiàn)FRET和UCNPs熒光猝滅；進(jìn)一步加入OTA后，UCNPs熒光恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的定量檢測(cè)。該方法具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

YCl3·6H2O(99.99%)、YbCl3·6H2O(99.9%)、ErCl3(99.9%)、1-十八烯(1-ODE，90%)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、嗎啉乙磺酸(MES)、硫酸慶大霉素，以上試劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚丙烯酸(PAA，相對(duì)分子質(zhì)量2 000)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(sulfo-NHS)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)有限公司；甲醇、乙醇、油酸(OA)、二甘醇(DG)、乙二醇(EDG)、甲苯、氫氧化鈉(NaOH)、氟化銨(NH4F)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)等試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；赭曲霉毒素A購(gòu)自江蘇美正生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1購(gòu)自瑪雅試劑有限公司；交鏈孢酚單甲醚、交鏈孢酚購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ·cm的Millipore超純水，其余試劑均為市售分析純。赭曲霉毒素A適配體序列[27]為氨基修飾：5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-NH2-3'，赭曲霉毒素A適配體互補(bǔ)序列為巰基修飾：5'-CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-SH-3'，以上所有寡核苷酸序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

F-7000 全波長(zhǎng)熒光掃描儀(日本日立有限公司)；980 nm 半導(dǎo)體激光器(北京海特光電有限責(zé)任公司)；紫外分光光度計(jì)(UV-2802 pcs，優(yōu)尼柯公司)；透射電鏡(JEOL-2100，日本電子株式會(huì)式)；VS-100C恒溫混勻儀(無(wú)錫沃信儀器有限公司)；傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司)；X射線衍射儀(德國(guó)布魯克科技有限公司)；HI-6A型數(shù)字控溫磁力攪拌電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；分析天平、pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗儀(上海卓博精密機(jī)械有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1金納米粒子的制備金納米粒子(AuNPs)采用檸檬酸三鈉還原的方法合成[28]：將100 mL 0.01%的氯金酸溶液加入錐形瓶中攪拌加熱至沸騰；保持沸騰5 min后，將2 mL 1%的檸檬酸三鈉快速加入上述溶液；繼續(xù)加熱至溶液顏色變?yōu)榫萍t色，再煮沸10 min停止加熱，攪拌冷卻至室溫。所得AuNPs的濃度為3 nmol/L。

1.2.2上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的制備及表面改性根據(jù)文獻(xiàn)[29]的方法用高溫?zé)峤夥ê铣蒒aYF4∶Yb,Er UCNPs：取0.208 0 g YCl3·6H2O、0.110 8 g YbCl3·6H2O和0.007 8 g ErCl3加入燒瓶中；然后加入6 mL 油酸及15 mL 1-十八烯，將上述混合溶液攪拌加熱至160 ℃；待形成透明溶液后，冷卻至室溫；將10 mL甲醇溶液(含有0.1 g NaOH，0.148 2 g NH4F)緩慢加至上述溶液中攪拌30 min；然后將上述溶液加熱至100 ℃，100 ℃加熱30 min以除去甲醇；最后將溫度升至300 ℃ ，并在氬氣的保護(hù)下反應(yīng)1 h；反應(yīng)完成后冷卻至室溫，所得溶液用乙醇沉淀離心清洗3次，即得油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs。

油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs溶于非極性溶劑，為將其用于生物標(biāo)記等，根據(jù)文獻(xiàn)[30]方法利用鏈交換法對(duì)其進(jìn)行表面改性，使其可以溶于極性溶液：首先將150 mg 聚丙烯酸加入30 mL二甘醇中；將混合物加熱到110 ℃，待形成透明溶液后，加入50 mg 油酸包被的NaYF4∶Yb,Er UCNPs甲苯溶液2 mL；在氬氣的保護(hù)下110 ℃保持1 h，然后升溫至240 ℃反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后待溶液冷卻至室溫；加入乙醇沉淀材料，離心收集并用乙醇和水分別清洗3次，即得水溶性的PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs。

1.2.3赭曲霉毒素A能量供體探針的制備稱(chēng)取5 mg PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs分散于5 mL10 mmol/L的MES溶液(pH 5.6)中，超聲至充分溶解；加入0.6 mL 2 mg/mL的EDC溶液及0.2 mL 2 mg/mL的NHS 溶液，將上述溶液混勻后于37 ℃活化2 h；離心收集材料并用10 mmol/L pH 7.0的PB緩沖液清洗3次，最后重懸于5 mL PB緩沖液中，并加入10 μL 100 μmol/L的OTA適配體37 ℃過(guò)夜孵育；孵育完成后，離心收集沉淀并用PB緩沖液清洗3次，得到OTA適配體修飾的上轉(zhuǎn)換熒光納米探針apt-UCNPs，將其重懸于BB 緩沖液(10 mmol/L Tris，pH 8.5，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl 和 20 mmol/L CaCl2)中，4 ℃保存。所得apt-UCNPs質(zhì)量濃度為 1 mg/mL。

1.2.4赭曲霉毒素A能量受體探針的制備取1 mL AuNPs溶液與2 μL 500 μmol/L的OTA適配體互補(bǔ)鏈混勻，37 ℃孵育30 min；然后加入500 mmol/L pH 3.0的檸檬酸鹽5 μL，混勻后37 ℃孵育2 h；孵育完成后12 000 r/min離心15 min，得到OTA適配體互補(bǔ)鏈修飾的金納米粒子 cDNA-AuNPs，將其重懸于1 mL 10 mmol/L PBS緩沖液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5赭曲霉毒素A的檢測(cè)將100 μL 0.1 mg/mL apt-UCNPs用稀釋10倍后的BB緩沖液(0.1BB緩沖液)稀釋?zhuān)c40 μL cDNA-AuNPs室溫孵育1 h后；加入60 μL不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品(0.1BB緩沖液稀釋)繼續(xù)孵育1 h，利用980 nm激光源激發(fā)反應(yīng)溶液，測(cè)量其熒光強(qiáng)度。

1.2.6特異性分析分別配制質(zhì)量濃度均為10 μg/L的赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、硫酸慶大霉素、交鏈孢酚單甲醚和交鏈孢酚(Alternariol，AOH)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。利用上述適配體傳感器測(cè)定熒光強(qiáng)度，通過(guò)對(duì)比熒光強(qiáng)度的變化值來(lái)評(píng)價(jià)構(gòu)建的OTA適配體傳感器的特異性。

1.2.7加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)首先對(duì)超市所購(gòu)買(mǎi)的啤酒樣品進(jìn)行預(yù)處理[31]：取脫氣酒類(lèi)試樣(含CO2的酒類(lèi)樣品先置于4 ℃冷藏30 min，過(guò)濾或者超聲)20 g，置于25 mL容量瓶中，加提取液(稱(chēng)取 150 g 氯化鈉、20 g 碳酸氫鈉，加水定容至 1 L)定容至刻度，混勻，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清，收集濾液備用。將3種不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品加入稀釋5倍的市售啤酒樣品中，利用上述OTA適配體傳感器檢測(cè)OTA含量，計(jì)算回收率。

圖1 OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(A) 與PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(B)的TEM圖以及OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs及PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs相同濃度下的熒光光譜圖(C)Fig.1 TEM images of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(A) and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(B),and fluorescence spectra of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(C)

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的表征

2.1.1上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的表征通過(guò)透射電鏡(TEM)觀察可知，油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs在甲苯中的單分散性良好，粒徑約為35 nm(圖1A)；通過(guò)PAA改性后的NaYF4∶Yb,Er UCNPs在水中的單分散性依舊良好，粒徑約為43 nm(圖1B)。由熒光光譜圖(圖1C)可見(jiàn)，NaYF4∶Yb,Er UCNPs于980 nm激發(fā)下，在532、546、662 nm處有明顯的特征發(fā)射峰，其分別代表了2H11/2、4S3/2及4F9/2向4I15/2的能級(jí)躍遷[32]。雖然PAA改性后的NaYF4∶Yb,Er UCNPs相對(duì)于油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs的熒光強(qiáng)度減弱，但并不影響后續(xù)使用。

通過(guò)X射線衍射圖譜(XRD，圖2)可知，材料改性前后晶相的 XRD 峰與標(biāo)準(zhǔn)卡 JCPDS NO.28-1192 的出峰位置相匹配，說(shuō)明材料改性前后的晶相均屬于六方相，具有較高的結(jié)晶度；經(jīng)過(guò)鍵交換改性后，晶相并未改變。由傅立葉紅外圖譜(FT-IR)(圖3)可知，OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs在2 924 cm-1和 2 854 cm-1處分別有亞甲基(—CH2—)的非對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，在 1 568 cm-1和 1 465 cm-1處有羧基(COO—)的非對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰；進(jìn)行鏈交換之后，PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs在2 926 cm-1處—CH2—的吸收峰幾乎消失，而在 1 732 cm-1及1 409 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)羧基吸收峰，表明PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs表面的羧基數(shù)量增加并且取代了油酸陰離子。

2.1.2金納米粒子的表征通過(guò)TEM觀察可知(圖4A)，AuNPs的粒徑大約為25 nm，單分散性良好。由紫外吸收光譜(圖4B)可知，AuNPs在523 nm處有最強(qiáng)吸收，其縱向吸收峰與PAA-NaYF4:Yb,Er UCNPs的發(fā)射光譜有很大程度的重合，有助于提高熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。

圖2 OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs及PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs的XRD圖Fig.2 XRD patterns of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs

圖3 OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs及PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs的FT-IR圖Fig.3 FT-IR spectra of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs

圖4 AuNPs的TEM圖(A)與PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs的熒光光譜及AuNPs的紫外吸收光譜(B)Fig.4 TEM image of AuNPs(A) and fluorescence spectrum of PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and UV-Vis spectrum of AuNPs(B)

2.2 赭曲霉毒素A能量供體及受體探針的表征

圖5 apt-UCNPs，apt-UCNPs與AuNPs孵育，apt-UCNPs與cDNA-AuNPs孵育，apt-UCNPs與cDNA-AuNPs孵育后加OTA孵育的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of apt-UCNPs，apt-UCNPs+AuNPs，apt-UCNPs+cDNA-AuNPs and apt-UCNPs+cDNA-AuNPs+OTA

AuNPs的紫外吸收光譜顯示，AuNPs在與巰基化的OTA適配體互補(bǔ)鏈孵育連接后，在260 nm出現(xiàn)DNA的最大吸收峰，說(shuō)明AuNPs與OTA適配體互補(bǔ)鏈形成了Au—S鍵，cDNA成功連接到AuNPs表面；AuNPs加入NaCl后很容易聚集，而cDNA-AuNPs具有較高的耐鹽性，進(jìn)一步證明了cDNA已連接到AuNPs表面，成功制備能量受體。而NaYF4∶Yb,Er UCNPs的紫外吸收光譜顯示，PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs在紫外區(qū)沒(méi)有吸收，在與氨基化的OTA適配體孵育連接之后，在260 nm處出現(xiàn)了DNA的特征吸收峰，說(shuō)明OTA適配體連接到PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs表面，成功制備能量供體探針。

本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理是基于能量供體和能量受體之間合適的空間距離和光譜的高度重疊實(shí)現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致UCNPs的熒光猝滅；而當(dāng)體系中加入OTA時(shí)，OTA優(yōu)先與能量供體適配體結(jié)合，導(dǎo)致兩種探針的空間距離拉大，不再滿足FRET的發(fā)生條件，所以UCNPs被猝滅的熒光得以恢復(fù)。通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證明此原理。由圖5的熒光光譜可知，apt-UCNPs與AuNPs孵育時(shí)并不會(huì)連接發(fā)生FRET導(dǎo)致熒光猝滅，只有修飾了cDNA-AuNPs才會(huì)與apt-UCNPs通過(guò)核酸雜交結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅；而當(dāng)體系中加入OTA時(shí)，由于OTA與apt-UCNPs上OTA適配體的特異性結(jié)合，破壞了FRET，apt-UCNPs的熒光得以恢復(fù)。

2.3 基于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料與金納米粒子熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)赭曲霉毒素A的方法研究

2.3.1赭曲霉毒素A適配體濃度的影響本實(shí)驗(yàn)將OTA適配體連接PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs作為能量供體，其中OTA適配體的濃度會(huì)影響apt-UCNPs的猝滅程度，通過(guò)加入不同濃度的OTA適配體與PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs結(jié)合來(lái)優(yōu)化最佳濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著OTA適配體濃度的增加，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度I/I0(I0代表只有apt-UCNPs時(shí)的熒光強(qiáng)度，I代表加入cDNA-AuNPs時(shí)apt-UCNPs的熒光強(qiáng)度)不斷增強(qiáng)，當(dāng)OTA適配體濃度增加至100 μmol/L時(shí)，猝滅達(dá)到飽和，因此選擇100 μmol/L作為OTA適配體的濃度。

2.3.2BB緩沖液濃度的優(yōu)化高濃度的BB緩沖液可能會(huì)導(dǎo)致cDNA-AuNPs的聚集，低濃度的BB緩沖液不利于apt-UCNPs與OTA及cDNA-AuNPs的結(jié)合[33]，從而影響熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因此需通過(guò)不同濃度的BB緩沖液稀釋apt-UCNPs來(lái)優(yōu)化BB緩沖液的濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)BB緩沖液稀釋倍數(shù)為10時(shí)，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度最高，因此選擇稀釋10倍的BB緩沖液(0.1BB)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.3能量受體探針體積的影響能量受體cDNA-AuNPs的濃度會(huì)影響apt-UCNPs的猝滅程度以及熒光恢復(fù)程度，從而影響檢測(cè)的靈敏度。通過(guò)改變cDNA-AuNPs的體積來(lái)改變體系中cDNA-AuNPs的濃度優(yōu)化出最佳的猝滅效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著cDNA-AuNPs體積的增加，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度I/I0不斷增強(qiáng)。當(dāng)達(dá)到40 μL時(shí)，猝滅接近飽和；繼續(xù)增大cDNA-AuNPs的體積，猝滅效果會(huì)更好，但過(guò)量的cDNA-AuNPs易導(dǎo)致非特異性猝滅，不利于熒光恢復(fù)，因此選擇cDNA-AuNPs的體積為40 μL。

2.3.4能量供體探針濃度的影響能量供體探針的濃度會(huì)影響猝滅效果，進(jìn)而影響檢測(cè)的靈敏度，因此對(duì)apt-UCNPs的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)apt-UCNPs為0.1 mg/mL 時(shí)，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅效果最好；隨著apt-UCNPs濃度的增大，猝滅效果減弱，因此選擇apt-UCNPs的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。

2.3.5能量供體及受體探針?lè)磻?yīng)時(shí)間的影響由于堿基互補(bǔ)配對(duì)使能量供體apt-UCNPs與能量受體cDNA-AuNPs結(jié)合發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，導(dǎo)致能量供體apt-UCNPs的熒光猝滅。將apt-UCNPs與cDNA-AuNPs孵育不同的時(shí)間，通過(guò)對(duì)比apt-UCNPs的猝滅程度來(lái)選出最佳的孵育時(shí)間。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度不斷增加。當(dāng)孵育60 min時(shí)，猝滅程度達(dá)到最大；之后，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，猝滅程度基本保持不變，說(shuō)明apt-UCNPs與cDNA-AuNPs已經(jīng)完全結(jié)合，因此選擇apt-UCNPs與cDNA-AuNPs的反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.3.6赭曲霉毒素A孵育時(shí)間的影響apt-UCNPs與cDNA-AuNPs結(jié)合發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致apt-UCNPs的熒光猝滅；而OTA的加入會(huì)使得OTA適配體改變空間結(jié)構(gòu)與OTA結(jié)合形成復(fù)合物，使得apt-UCNPs與cDNA-AuNPs分離，兩者之間的距離拉大，apt-UCNPs的熒光得到恢復(fù)。為了達(dá)到最佳的熒光恢復(fù)效果，需對(duì)OTA的孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。將OTA標(biāo)準(zhǔn)液加入能量供體及受體反應(yīng)后的體系中，結(jié)果顯示，隨著孵育時(shí)間的增加，apt-UCNPs在546 nm處的熒光恢復(fù)率(Ia-I)/I0(式中，I0代表只有apt-UCNPs時(shí)的熒光強(qiáng)度，I代表加入cDNA-AuNPs時(shí)apt-UCNPs的熒光強(qiáng)度，Ia代表apt-UCNPs和cDNA-AuNPs反應(yīng)后的體系中加入OTA之后的熒光強(qiáng)度)不斷增加。當(dāng)孵育60 min后，熒光恢復(fù)達(dá)到最大；之后基本保持平衡，因此選擇OTA的孵育時(shí)間為60 min。

2.3.7赭曲霉毒素A檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線利用cDNA-AuNPs導(dǎo)致apt-UCNPs熒光猝滅，而OTA的加入對(duì)apt-UCNPs起到熒光恢復(fù)的作用，構(gòu)建了OTA適配體傳感器。在上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，得到加入不同濃度OTA孵育后的熒光光譜。當(dāng)OTA質(zhì)量濃度在0.001～10 ng/mL范圍內(nèi)時(shí),apt-UCNPs 在546 nm處的熒光恢復(fù)率(Ia-I)/I0與OTA的濃度呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.077 22logx+0.033 88，r2=0.980 5，檢出限(S/N=3)為0.001 ng/mL。與基于納米材料檢測(cè)OTA的其他方法作比較(表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法與其他方法相比具有一定的優(yōu)勢(shì)。

表1 幾種基于納米粒子檢測(cè)OTA的方法比較Table 1 Comparison of several methods for OTA detection based on nanoparticles

2.4 特異性分析

選用黃曲霉毒素B1(AFB1)、硫酸慶大霉素(GS)、交鏈孢酚單甲醚(AME)和交鏈孢酚(AOH)作為可能的共存毒素作特異性研究。結(jié)果顯示，10 ng/mL的其他毒素對(duì)于反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯的熒光恢復(fù)作用，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的OTA適配體傳感器具有良好的特異性。

2.5 啤酒樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)該反應(yīng)體系的實(shí)用性，將其應(yīng)用于市售啤酒樣品的加標(biāo)回收檢測(cè)。結(jié)果如表2所示，回收率為100%～119%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.3%～4.9%，說(shuō)明本方法在實(shí)際樣品的檢測(cè)中具有一定的準(zhǔn)確性及可靠性。

表2 啤酒樣品中OTA的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=3)Table 2 Recovery results of added standard OTA in beer samples using the method(n=3)

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)上轉(zhuǎn)換熒光納米材料與金納米粒子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移建立了OTA適配體傳感器。經(jīng)過(guò)對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)cDNA-AuNPs的體積為40 μL，apt-UCNPs的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，探針之間及靶標(biāo)孵育時(shí)間為60 min時(shí),OTA的檢測(cè)范圍為0.001～10 ng/mL，檢出限可達(dá)0.001 ng/mL。經(jīng)過(guò)特異性研究及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，證明該方法可用于實(shí)際樣品檢測(cè)，具有方法靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于食品等領(lǐng)域中OTA的檢測(cè)。

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