李 素，肖義陂，武 樂，姜萌萌，劉 杰，嚴(yán)喜鸞*

(1.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西 南昌 330031；2.南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330008；3.江西省腫瘤醫(yī)院，江西 南昌 330029；4.南昌大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330031)

納米金(Gold nanoparticles，AuNPs)是指粒徑為納米級別的金顆粒，常被用作免疫學(xué)檢測標(biāo)記物或探針，是近年來納米材料研究熱點之一[1]。它具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)以及獨特的電化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，在臨床診斷治療以及藥物和生物小分子檢測方面被廣泛應(yīng)用[2-3]。

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的真菌毒素，穩(wěn)定存在于小麥、玉米、可可豆等農(nóng)作物中[4-5]。在人血清中，OTA具有很長的半衰期，不易被降解。此外，OTA還可產(chǎn)生各種嚴(yán)重的毒性，例如胚胎毒性、致畸性、致癌性、免疫毒性、肝毒性等[6]，已被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)確定為ⅡB類致癌物[7]。目前，歐盟對烤咖啡中OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 ng/mL[8]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2011中,規(guī)定谷物和豆類及其制品中OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 μg/kg[9]。

常用的OTA檢測方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜-熒光檢測法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[10-13]。另外，基于OTA免疫抗體分子作為識別元件的免疫檢測方法，近年來也有不少報道[14-15]。但色譜法對樣品的純度及檢測器要求比較高，設(shè)備價格昂貴，前處理過程比較繁瑣，檢測周期長。本文所采用的金標(biāo)記羥胺放大化學(xué)發(fā)光檢測法具有設(shè)備價廉、操作簡單、線性范圍廣、靈敏度高、分析時間短等優(yōu)點[16]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BPCL微弱發(fā)光測量儀(中國科學(xué)院生物物理研究所)；HZ-9211KB恒溫振蕩器(太倉市科教器材廠)；磁性分離器(日本Toyobo公司)；Eppendorf Research系列移液器(德國Eppendorf公司)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Nano-S馬爾文納米粒度儀(美國Malvern公司)；紫外可見分光光度計(北京普析分析儀器公司)。

羧基磁性微球(直徑1.5 μm，20.3 mg/mL)購于德國Polysciences公司；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)購于美國Sigma公司；赭曲霉毒素A(OTA)標(biāo)準(zhǔn)品購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；魯米諾購于百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；鏈霉親和素購于北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、咪唑、三羥甲基胺基甲烷(Tris)購于上海愛紫特生物科技有限公司；氯金酸購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司；碳酸鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、濃鹽酸、檸檬酸三鈉、吐溫20(Tween20)購于西隴化工股份有限公司；以上試劑除Tween20為化學(xué)純外，其他均為分析純。實驗樣品為雪花啤酒；實驗用水為超純水。

核酸序列均購于上海生工生物有限公司，序列如下：捕獲探針：5’-CACCCACACCCIATCAAAAAAAAAA-NH2-3’；OTA 適體：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；生物素化報告序列(biotin-reporter DNA)：5’-CACCCACACCCGATC-biotin-3’。

1.2 實驗方法

1.2.1鏈霉親和素納米金的制備[17]取100 mL 0.01% 氯金酸于三口燒瓶中，置于集熱式磁力加熱攪拌器中攪拌加熱至沸騰，迅速加入4 mL 2%檸檬酸三鈉，沸騰10 min后自然冷卻，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)至pH 6.8～7.0，再加入10 mL 0.022 mg/mL鏈霉親和素，反應(yīng)10 min，加入500 μL 1% PVP穩(wěn)定劑，6 000 r/min離心1 h，沉淀再用1% PVP洗滌3次，最后用0.1 mol/L PBS(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4·12H2O，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)定容至10 mL，于4 ℃保存待用。

1.2.2基于磁性微球載體與適體技術(shù)的金納米生物傳感器制備取40 μg羧基磁性微球于1.5 mL離心管中，置于磁性分離器進行磁性分離，移去上清液，用100 μL 0.1 mol/L的咪唑緩沖液(pH 6.0)洗滌3次；加入100 μL含EDC的0.1 mol/L咪唑緩沖液，使微球重新懸浮，37 ℃下活化20 min；再加入20 pmol氨基修飾的捕獲探針，37 ℃下振蕩孵育1 h；磁性分離并用100 μL PBST(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4·12H2O，2 mmol/L KH2PO4，0.05% Tween20，pH 7.4)洗滌3次；10% PVP進行封閉反應(yīng)，37 ℃下振蕩孵育1 h；磁性分離并使用100 μL PBST洗滌3次；加入10 pmol OTA適配體，37 ℃下振蕩孵育1 h；磁性分離并洗滌3次；再加入20 pmol生物素修飾的報告序列，37 ℃下振蕩孵育1 h；磁性分離并洗滌3次；加入100 μL由BB緩沖液(10 mmol/L Tris，0.12 mol/L NaCl，0.005 mol/L KCl，0.02 mol/L CaCl2，pH 8.5)配制的不同濃度OTA，37 ℃下振蕩孵育1 h，磁性分離洗滌；OTA 競爭下部分生物素報告序列，繼續(xù)加入與生物素特異性結(jié)合的50 μL 1% PVP的3倍稀釋的鏈霉親和素納米金(SA-AuNPs)，37 ℃下振蕩孵育0.5 h，磁性分離并洗滌3次；待測。

1.2.3羥胺放大檢測將100 μL 0.05 mmol/L HAuCl4和100 μL 0.05 mmol/L NH2OH 加入到磁性微球復(fù)合物中并置于37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)0.5 h，然后加入50 μL 4 ℃水溴飽和液，常溫反應(yīng)10 min后，60 ℃反應(yīng)20 min；取50 μL反應(yīng)液，再加入100 μL 1.0 μmol/L魯米諾的NaOH溶液迅速混合后，立即放入化學(xué)發(fā)光儀中測定。實驗以化學(xué)發(fā)光信號最高值作為最終信號值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

首先設(shè)計一條與捕獲序列和報告序列均能雜交，且包含OTA適體的序列，然后利用金納米與魯米諾化學(xué)發(fā)光原理，以羧基磁性微球作為固定和分離載體,通過捕獲序列將適體序列連接于磁性微球，加入OTA和生物素修飾的報告序列競爭結(jié)合適體，然后加入與生物素特異性結(jié)合的鏈霉親和素金納米粒子，OTA加入量越多，磁性微球上生物素修飾的報告序列隨著適體離開而脫離的越多，導(dǎo)致留在磁性微球上的金納米量越少，從而實現(xiàn)OTA的檢測。另外，利用羥胺/Au3+在較小粒徑的金粒子表面可聚集形成更大顆粒的金粒子的特點，可極大提高化學(xué)發(fā)光檢測OTA的靈敏度。實驗原理如圖1所示。

圖1 羥胺放大金納米?；瘜W(xué)發(fā)光檢測OTA的檢測原理圖Fig.1 Schematic representation of hydroxylamine amplified AuNPs assay for OTA by chemiluminescence

圖2 金納米的粒徑分布圖Fig.2 Size distribution of AuNPs

圖3 納米金溶膠的紫外-可見光吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectrogram of AuNPs

2.2 納米金的表征

采用馬爾文粒度儀測定所制備的金納米粒徑，并用紫外可見分光光度計掃描其最大吸收峰。金納米粒子的粒徑分布如圖2所示，結(jié)果得出粒徑的平均值為21.04 nm。紫外-可見光吸收光譜圖如圖3所示，由圖可知，紫外光譜的最大吸收峰為520 nm，無其他雜峰，且其吸收峰的寬度較小，說明此納米金溶膠純凈且粒徑分布均勻。

2.3 檢測條件的優(yōu)化

2.3.1羧基磁性微球用量的優(yōu)化羧基磁性微球載體是實現(xiàn)傳感器純化分離的重要保障。在其他反應(yīng)條件相同的情況下，考察了不同磁性微球用量(20、40、60、80、100 μg)對CL信號的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)羧基磁性微球用量為40 μg時，ΔCL信號值(化學(xué)發(fā)光空白值與實驗值的差值)達到峰值，此后隨著磁性微球用量的增加ΔCL信號值反而下降。這可能是由于磁性微球表面結(jié)合的捕獲探針用量增加，使得與捕獲探針雜交的OTA適體量也增大，從而導(dǎo)致ΔCL信號值下降。因此，羧基磁性微球的最佳用量為40 μg。

2.3.2氨基捕獲探針用量的優(yōu)化實驗對氨基捕獲探針用量(10、15、20、25、30 pmol)進行了優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)氨基捕獲探針用量為20 pmol時，ΔCL信號值達最大，此后隨著捕獲探針用量的增加，ΔCL信號值急劇下降。這可能是由于磁性微球表面單位面積結(jié)合了過多的捕獲探針，增加了空間位阻，從而降低了捕獲探針與OTA適體的雜交效率，導(dǎo)致ΔCL信號值下降。因此，捕獲探針的最佳用量為20 pmol。

2.3.3OTA適配體用量的優(yōu)化實驗對OTA適配體用量(2、5、10、15、20 pmol)進行了考察，結(jié)果顯示，當(dāng)OTA適配體用量為10 pmol時，ΔCL信號值達最大值，此后隨著OTA適配體的用量增加，ΔCL信號值下降?？赡苁怯捎谶^量的OTA適配體使得磁性微球上連接的OTA適配體用量增加，CL信號值增大，從而使ΔCL信號值降低。因此，OTA適配體的最佳用量為10 pmol。

2.3.4生物素化報告序列用量的優(yōu)化實驗對生物素化報告序列用量(5、10、20、30、40 pmol)進行了考察，結(jié)果顯示當(dāng)生物素化報告序列用量為20 pmol時，ΔCL信號值達最大值，之后隨著生物素化報告序列用量的增加ΔCL信號值下降。這可能是由于磁性微球表面的報告序列過于密集，影響了生物素與鏈霉親和素納米金的結(jié)合，從而導(dǎo)致ΔCL信號值下降。因此，生物素化報告序列的最佳用量為20 pmol。

2.3.5金納米粒子顆粒直徑的優(yōu)化不同用量的檸檬酸三鈉會得到不同直徑的金納米粒子[18-21]，實驗對檸檬酸三鈉的用量(1.4、2.6、4、6、8 mL)進行了考察，結(jié)果表明當(dāng)檸檬酸三鈉的用量為4 mL時(金納米粒子的直徑約為20 nm)，ΔCL信號值達到最大，此后隨著檸檬酸三鈉用量的增加ΔCL信號值下降。因此，金納米粒子顆粒的最佳直徑約為20 nm。

2.3.6SA-AuNPs用量的優(yōu)化實驗用1% PVP對不同SA-AuNPs稀釋倍數(shù)(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)進行了考察，結(jié)果顯示，隨著稀釋倍數(shù)的增加，ΔCL信號值也增加，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1∶3時，ΔCL信號值達到最大，此后隨著稀釋倍數(shù)的增加ΔCL信號值下降。因此，SA-AuNPs最佳的稀釋倍數(shù)為1∶3。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在優(yōu)化的實驗條件下(40 μg羧基磁性微球，20 pmol氨基捕獲探針，10 pmol適配體，20 pmol生物素化報告序列，20 nm金納米粒子，1∶3的SA-AuNPs)，對一系列不用濃度的OTA進行化學(xué)發(fā)光檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，在OTA質(zhì)量濃度為0.01～50 ng/mL范圍內(nèi)，ΔCL信號值(Y)與OTA質(zhì)量濃度的對數(shù)(X)呈良好線性關(guān)系，線性方程為Y=1.80×105X-1.81×105，r2=0.992 5，檢出限(L=KSb/S,K=3)為1.58×10-3ng/mL。

2.5 檢測性能評價

實驗對啤酒樣品進行前處理[22]，將啤酒在聲波浴中加熱脫氣30～60 min，取10 mL啤酒加入0.1 g PVP，將混合物在室溫下?lián)u動2 min。過濾后，將溶液調(diào)至pH 7.2，稀釋100倍后于4 ℃保存?zhèn)溆谩＿x取3個不同濃度水平的OTA(1、5、10 ng/mL)對啤酒進行加標(biāo)回收試驗，平行測定3次。結(jié)果顯示，平均回收率為97.4%～105.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.0%～5.5%。本方法準(zhǔn)確性較高，精密度良好，可用于實際樣品中OTA的檢測。

表1比較了近年來不同方法對OTA的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本方法具有較高的靈敏度，線性范圍更寬，且操作簡單更有利于實際操作。

表1 不同分析方法檢測OTA的比較Table 1 Comparison of methods for OTA detection

3 結(jié) 論

本實驗以磁性微球作為固定載體，通過適體技術(shù)將AuNPs應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，并利用羥胺/Au3+在小粒徑的AuNPs表面具有沉積效應(yīng)的特性來顯著提高檢測靈敏度，從而構(gòu)建了一種高靈敏度檢測OTA的化學(xué)發(fā)光方法。加標(biāo)回收結(jié)果表明本方法可用于實際樣品中OTA的檢測。此外，本方法兼具適配體和AuNPs的優(yōu)勢，靈敏度高、成本低且能快速篩查，為食品藥品安全檢測及分析提供了一種快速、簡便、靈敏的分析手段。

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