梁雨濤,宋立新,卜忐忐，李媛媛，巴 鑫，何 娟*,游利琴,谷克仁

(1.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南水利與環(huán)境職業(yè)學(xué)院 環(huán)境工程系，河南 鄭州 450001 )

磺胺類藥物是一種人工合成的抗菌藥，其價格低廉，在獸醫(yī)臨床上療效較為顯著，因此應(yīng)用越來越廣泛[1]。然而，濫用獸藥極易造成動物源食品中有害物質(zhì)殘留，不僅對人體健康造成危害，而且對畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境也造成極大危害[2-3]。因此獸藥殘留的有效檢測對人類的飲食安全極為重要。

目前應(yīng)用較為廣泛的獸藥殘留檢測方法均以高效液相色譜、液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用等精密儀器進(jìn)行檢測[4-6]，因此對實(shí)際樣品進(jìn)行更為有效的前處理變得更為關(guān)鍵。分子印跡固相萃取是一種重要的樣品預(yù)處理技術(shù)，具有選擇性高、穩(wěn)定性好和適用性廣等特點(diǎn)；同時利用該技術(shù)可合成對模板分子具有專一性識別作用的聚合物，能有效在復(fù)雜基質(zhì)中吸附目標(biāo)分子[7-9]。

原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(Atom transfer radical polymerization，ATRP)是一種新型高效合成聚合物的方法，可將活性差別較大的單體相結(jié)合，聚合反應(yīng)后可以形成共聚單體隨時間的延長呈梯度變化的梯度共聚物，并且此方法適用的單體種類較多，大多數(shù)單體如苯乙烯、甲基丙烯酸酯等均可順利反應(yīng)，且反應(yīng)過程可控，有利于獲得符合分子量要求的聚合物。片段印跡技術(shù)是在聚合反應(yīng)的過程中，加入目標(biāo)分析物的一個片段或其結(jié)構(gòu)類似物作為替代模板合成一種新型的印跡聚合物。因大部分目標(biāo)分析物為有毒有害物質(zhì)，此方法可有效避免目標(biāo)分析物的泄露，減少對有害物質(zhì)的使用，同時若洗脫過程中模板分子未洗脫完全，液相色譜分析時亦不會對目標(biāo)分析物產(chǎn)生影響[10-12]。因此在本實(shí)驗(yàn)中嘗試使用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合與片段印跡技術(shù)相結(jié)合的新方法。

本文以食品中殘留的磺胺類物質(zhì)作為研究對象，以磺胺類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物4,6-二氯嘧啶作為替代模板，利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備片段印跡聚合物，考察反應(yīng)條件對其外觀特性、吸附、選擇和排阻性能等的影響規(guī)律。以合成的聚合物為新型材料，對樣品中的獸藥殘留進(jìn)行分析測定。通過電鏡掃描對所合成聚合物的表面形態(tài)進(jìn)行表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

LC-10AT高效液相色譜、UV2550紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。

1.2 印跡聚合物的制備

取2，2′-聯(lián)吡啶 40.95 mg(0.25 mmol)、環(huán)己酮13.9 mL、 GMA 5.75 mL(45 mmol)和氯化芐23 μL，置于三口燒瓶內(nèi)，通氮?dú)獬?。加入CuCl 17.3 mg和 4，6-二氯嘧啶0.4 g(2.5 mmol)，超聲使其溶解，抽真空，再通入氮?dú)? min，反復(fù)3次。在60 ℃下機(jī)械攪拌5 h。反應(yīng)結(jié)束后，取200 mL甲醇于燒杯中，磁力攪拌，將反應(yīng)溶液勻速滴加到燒杯中得白色固體，抽濾，烘干備用。

將制得的印跡聚合物(MIPs)用甲醇-乙酸(9︰1，體積比)混合液進(jìn)行洗脫，至檢測不出模板分子，換用純甲醇洗至溶液呈中性。烘干備用。

采用相同比例和方法制備非印跡聚合物(NIPs，未加模板分子)。

1.3 聚合物的吸附性能

分別稱取MIPs和NIPs 30 mg，量取4 mL質(zhì)量濃度為100 mg/L的 SMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，手動振蕩，放置24 h。以甲醇-水(9︰1，體積比)作為高效液相色譜法(HPLC)測定的流動相，測定波長為220 nm，流速為1 mL/min。根據(jù)高效液相色譜可以測得一定濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，然后依據(jù)峰面積與溶液濃度的線性關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式Q=(C1-C2)×V/m計算MIPs和NIPs的相對吸附量Q(mg/g)。式中，C1為 SMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液的原始質(zhì)量濃度(mg/L)；C2為吸附后SMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液底物的質(zhì)量濃度(mg/L)；V為 SMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(L)；m為印跡聚合物的質(zhì)量(g)。

1.4 吸附等溫線測試

稱取12份質(zhì)量為30 mg的MIPs，編號為1～12,分別加入質(zhì)量濃度為40～140 mg/L的SMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL，靜置24 h后測定。計算MIPs的相對吸附量Q(mg/g)，平行測定3次取平均值。

NIPs測定方法同上。

1.5 吸附速率測試

準(zhǔn)確稱取11份質(zhì)量為30 mg的MIPs，編號1～11,分別加入100 mg/L的SMZ標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL。1～4號每隔1 h測1次，5～8號每隔2 h測1次，9～11號每隔5 h測1次。計算MIPs的相對吸附量Q(mg/g)，平行測定3次取平均值。

1.6 選擇性吸附測定

稱取MIPs 30 mg，分別加入50 mg/L的SMZ、SMM、SD、SM2的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL，振蕩，吸附14 h。高效液相色譜法測定條件：流動相為乙腈-水(2︰8，體積比)，測定波長為254 nm，流速為1.0 mL/min。計算MIPs的相對吸附量Q(mg/g)。

NIPs測定方法同上。

1.7 實(shí)際樣品的分析

稱取MIPs 200 mg，用甲醇和水活化后濕法裝柱。選擇某品牌牛奶作為實(shí)驗(yàn)樣品，稱取適量，加熱煮沸除去上層脂肪，冷卻后準(zhǔn)確稱取10.0 g，以1.0 mL/min的流速通過固相萃取柱，待全部流出后，用5 mL蒸餾水淋洗，3 mL甲醇洗脫，測定牛奶中的獸藥殘留。高效液相色譜法測定條件：流動相為乙腈-水(2︰8)，測定波長為254 nm，流速為1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1反應(yīng)溫度對聚合物吸附量的影響在ATRP反應(yīng)中，若溫度過高，溶液中分子碰撞的幾率大大增加，形成的顆粒大小不均，進(jìn)而影響吸附性能，并且高溫(高于80 ℃)會引發(fā)GMA自身環(huán)氧鍵的斷裂，引入副反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而溫度太低(低于50 ℃)，無法使引發(fā)劑發(fā)揮作用，反應(yīng)不充分。因此實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度(50、55、60、65、70、75 ℃)對聚合物吸附量的影響。結(jié)果顯示，在60 ℃時合成的印跡聚合物的吸附性能最好，吸附量最大(1.05 mg/g)，故選擇最佳反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.1.2模板用量對聚合物吸附量的影響分子印跡技術(shù)利用洗脫模板后的三維空穴來達(dá)到選擇性識別的效果。在原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法中，模板用量過多，會使反應(yīng)溶液濃度過大，聚合反應(yīng)過慢，同時也會影響產(chǎn)率；模板用量少，會使聚合物孔穴利用率降低，影響聚合物的吸附能力。故設(shè)計用量比例如表1所示。吸附量測試和聚合物的外觀顯示，模板用量為0.3 g時，MIP的性狀較為疏松，呈白色均勻粉末狀，吸附量最大。

表1 模板用量對聚合物性狀和吸附量的影響Table 1 Effect of template amount on polymer properties and adsorption capacity

2.2 正交試驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素(A為模板用量，B為單體GMA用量，C為配體BPY用量，D為溫度)三水平的正交試驗(yàn)，對合成條件進(jìn)一步優(yōu)化(表2)。

表2 MIPs合成的正交實(shí)驗(yàn)Table 2 Orthogonal experiments on MIPs synthesis

由表2選出最優(yōu)合成條件：溫度為60 ℃，模板用量為0.3 g，GMA 用量為5.75 mL，BPY用量為40.95 mg，在此條件下合成聚合物，并測得其對SMZ溶液的吸附量為1.48 mg/g。與正交表的直觀分析結(jié)果相符。對比各因素的極差大小可知，四因素中模板用量是影響聚合物性能的顯著性因素。

2.3 片段印跡聚合物的電鏡掃描圖譜

如圖1所示，通過對合成的聚合物進(jìn)行電鏡掃描，發(fā)現(xiàn)聚合物為表面疏松多孔的顆粒，保證了合成的分子印跡聚合物具有較好的吸附性能和重現(xiàn)性。

圖1 片段印跡聚合物的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopy of fragment imprinted polymersA：1 000×；B：16 000×

圖2 吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherms

圖3 MIPs和NIPs對4種磺胺類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸附量Fig.3 Adsorption of standard solutions of four sulfa drugs by MIPs and NIPs

2.4 吸附等溫線測定

按照“1.4”方法進(jìn)行吸附等溫線測試，結(jié)果見圖2。由圖2可知，MIPs和NIPs的吸附量均隨標(biāo)準(zhǔn)液濃度的增加而增大，且兩者吸附量的差值隨濃度的增大而逐漸增加。這說明原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成的片段印跡聚合物具有更多的吸附孔穴以及更好的吸附性能。

2.5 吸附速率測定

按照“1.5”方法進(jìn)行吸附速率測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，印跡聚合物的吸附量隨吸附時間的延長不斷增加，但吸附時間大于11 h后，聚合物的吸附量基本不再變化，說明聚合物的有效吸附主要集中在前11 h。

2.6 選擇性吸附測定

按照“1.6”方法進(jìn)行吸附選擇性測定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，合成的印跡聚合物對SMZ有更好的選擇性，對SMZ的結(jié)構(gòu)類似物SMM、SD、SM2均有吸附且吸附量大于NIPs，說明合成的印跡聚合物能夠有效吸附磺胺類物質(zhì)。對比MIP對4種磺胺類物質(zhì)的吸附結(jié)果，發(fā)現(xiàn)聚合物對SMZ的吸附量最大，這是由于選擇的模板4,6-二氯嘧啶與SMZ的結(jié)構(gòu)更相似。

2.7 牛奶樣品的測定

對牛奶樣品進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)合成的MIPs對磺胺類似物顯示出較高的選擇性能和吸附性能，經(jīng)過SPE柱后分析目標(biāo)物被保留而雜質(zhì)不被保留，分析樣品得到了濃縮和凈化。分析結(jié)果顯示，本地牛奶中SMM、SD、SM2的含量分別為0.19、0.27、0.07 μg/kg，均小于國標(biāo)中規(guī)定的磺胺類獸藥殘留限量1.0 μg/kg，且未檢出其他磺胺類物質(zhì)。

3 結(jié) 論

以4，6-二氯嘧啶為替代模板合成片段印跡聚合物，通過正交試驗(yàn)得出最優(yōu)反應(yīng)條件為模板用量0.3 g，GMA 用量5.75 mL，BPY用量40.95 mg，即模板、功能單體、配體的摩爾比為10︰180︰1，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為5 h。選擇性吸附試驗(yàn)及對牛奶樣品的檢測結(jié)果表明，利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法和片段印跡技術(shù)相結(jié)合的新方法合成的新型片段印跡聚合物，對復(fù)雜的混合樣品及實(shí)際樣品均有較好的選擇性能和吸附性能，可用以制備固相萃取的吸附填料，在針對獸藥殘留分析的前處理過程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1] He X T,Wang Q,Nie X P,Yang Y T,Cheng Z.Environ.Sci.(何秀婷，王奇，聶湘平，楊永濤，程章.環(huán)境科學(xué)),2014,35(7):2728-2735.

[2] He M Y,Ye Y F,Liu Y,Li Z Z,Jiao B N,Zeng S M,Su X S.J.Instrum.Anal.(賀美艷,葉玉鳳,劉炎,李珍柱,焦必寧,曾紹梅,蘇學(xué)素.分析測試學(xué)報),2017,36(3)：325-330.

[3] Zhang Y,Li W Q,Zhou W E，Ren Z Q,Zhang F,Feng X S,Zhou Y,Li S H,Zheng Y.FoodSci.(張元,李偉青,周偉娥，任志芹，張峰，馮雪松，周昱，李紹輝，鄭陽.食品科學(xué)),2015,36(23):340-346.

[4] Qiu X Z,Huang Z W,Zhu H J,Jiao L J.J.Instrum.Anal.(丘秀珍,黃志偉,朱惠娟,焦琳娟.分析測試學(xué)報),2017,36(2):236-241.

[5] Yu H,Tao Y,Chen D,Pan Y H,Liu Z L,Wang Y L,Huang L L,Dai M H,Peng D P,Wang X,Yuan Z H.J.Chromatogr.B,2012,885/886(5):150-159.

[6] Zhang M M,Zhao W,Liu D C,Ji W H,Wang X.J.Instrum.Anal.(張明明,趙偉,劉代成,紀(jì)文華,王曉.分析測試學(xué)報),2016,35(6)：674-680.

[7] Gao L,Li X,Zhang Q,Dai J D,Wei X,Song Z L,Yan Y S,Li C X.FoodChem.,2014,156(4):1-6.

[8] He J,Song L,Chen S,Li Y Y,Wei H L,Zhao D X,Gu K R,Zhang S S.FoodChem.,2015,187:331-337.

[9] Król P,Chmielarz P.Prog.Org.Coat.,2014,77(5):913-948.

[10] Pyun J,Matyjaszewski K.Chem.Mater.,2001,13: 3436-3448.

[11] Niu Y L，Yang J，Dong J B，Gong B L．J.Instrum.Anal.(牛玉玲，楊靜，董佳斌，龔波林.分析測試學(xué)報)，2014，33(3): 283-288．

[12] Bayramoglu G，Arica M Y．BioprocessBiosyst.Eng．,2014，37(2): 205-215.