陳金慧，吳 春

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱150076)

木犀草素(Luteolin)是一種很具有代表性的天然黃酮，被國外確認(rèn)為是一種法定的食品色素[1].屬于弱酸性四羥基黃酮類化合物，目前發(fā)現(xiàn)主要存在于金銀花、菊花、荊芥、白毛夏枯草、洋薊、紫蘇屬、黃芩屬等天然藥物中和芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果實(shí)中，其他如橄欖油和紅酒等植物產(chǎn)品以及野鳳仙花、百里香草、唇形科植物筋骨草等也含有木犀草素[2].隨著對(duì)木犀草素研究的深入，發(fā)現(xiàn)它具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及增敏抗癌藥物活性等抗腫瘤作用，而且還具有抗炎、抗氧化以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)等作用[3].但由于木犀草素在水中的溶解度低，使其應(yīng)用受到限制.

固體脂質(zhì)顆粒(solid lipid particles，SLP)是20世紀(jì)90年代初逐漸發(fā)展起來的繼乳劑、脂質(zhì)體、微粒和毫微粒后一種新型納米膠囊有效成分的傳遞系統(tǒng).它綜合了納米乳和脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)，具有增加活性物質(zhì)親水性、物理穩(wěn)定性、延長生物半衰期等特點(diǎn)[4-5].將木犀草素制備成固體脂質(zhì)顆粒以提高其應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)對(duì)木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的包封率及其抗氧化能力進(jìn)行研究.

1 儀器與材料

1.1 儀器

ALC-110.4型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海一恒科學(xué)有限公司)；UV-5100B 型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；LD4-2A 型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；R2050型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)； KQ-25E型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；DL-CJ-1F型醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)

1.2 材料

木犀草素固體脂質(zhì)顆粒(實(shí)驗(yàn)室自制)；鄰苯三酚(上海第二化學(xué)試劑廠)；Tris(上?？婆d技術(shù)有限公司)；抗壞血酸(上海科興技術(shù)有限公司)，其他試劑均為分析純

2 方法

2.1 木犀草素固體脂質(zhì)顆粒包封率的測(cè)定

2.1.1 空白固體脂質(zhì)顆粒的制備

采用薄膜超聲法制備空白固體脂質(zhì)顆?；鞈乙篬6-7].

2.1.2 木犀草素對(duì)照品溶液的配制

稱取木犀草素50 mg置于100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.5 mg/mL的木犀草素對(duì)照品溶液.

2.1.3 木犀草素固體脂質(zhì)顆粒樣品溶液的配制

精密量取木犀草素固體脂質(zhì)顆?；鞈乙?.5 mL，超聲(8 min)，移至棕色容量瓶，用無水乙醇定容至50 mL，搖勻即得.

2.1.4 檢測(cè)波長的確定[8]

以無水乙醇為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)全波段掃描.

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，用無水乙醇定容至25 mL.以無水乙醇作為空白樣，在353 nm處測(cè)其吸光度，以吸光度(A)對(duì)木犀草素溶液的質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸分析.得到回歸方程為：A=0.172 9C+0.037 1,其線性相關(guān)系數(shù)R=0.9936.

2.1.6 精密度試驗(yàn)[9]

取對(duì)照品溶液于353 nm處測(cè)定吸光度，于1日內(nèi)測(cè)定5次.

2.1.7 離心強(qiáng)度的選擇[10-11]

精密稱取40 mg木犀草素，用空白固體脂質(zhì)顆粒溶液定容至100 mL，在超聲波中混勻，備用.分別移取所得到的混合液60 mL，置于6支離心管中，分別在500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心4 min，去除上層清液，用移液管移取5 mL乙醇于離心管，振蕩溶解沉淀，在353 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)上述線性方程計(jì)算得木犀草素的質(zhì)量比及相應(yīng)的離心度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5.

2.1.8 離心時(shí)間的選擇

精密稱取40 mg木犀草素，用空白固體脂質(zhì)顆粒溶液定容至100 mL，在超聲波中混勻，備用.分別移取所得到的混合液60 mL，置于6支離心管中，轉(zhuǎn)速為1 500 r/min，于不同的離心時(shí)間條件下進(jìn)行離心，去除上層清液層，移取5 mL乙醇加入上述7支離心管中，使沉淀溶解，于353 nm處測(cè)定紫外吸收吸光度(A)值，再根據(jù)上述公式計(jì)算出木犀草素的質(zhì)量比以及相應(yīng)的離心度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6.

2.1.9 分離度重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為考察低速離心法對(duì)空白固體脂質(zhì)顆粒和游離木犀草素分離的作用效果，精密稱取木犀草素1.0 mg，移取空白脂質(zhì)體2 mL，超聲波混合均勻，在1 000 r/min的離心條件下離心4 min，去除上層清液，用適量乙醇溶解沉淀后，置于353nm處測(cè)定A值，計(jì)算沉淀的木犀草素質(zhì)量，平行操作3次，計(jì)算出沉淀的木犀草素量分別占總量的平均比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7.

2.1.10 紫外分光光度法測(cè)包封率

取木犀草素固體脂質(zhì)顆粒樣品溶液適量，在1 000 r/min、120 s的條件下，棄去上層清液.用適量乙醇溶解沉淀，以乙醇為空白在353 nm處測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算固體脂質(zhì)顆粒中游離木犀草素的量，按下式計(jì)算包封率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8.

其中：n1為木犀草素的投入總量；n2為游離木犀草素的質(zhì)量.

2.2 木犀草素固體脂質(zhì)顆?？寡趸阅艿臏y(cè)定

2.2.1 對(duì)DPPH的清除作用[12-13]

DPPH溶液的配制：準(zhǔn)確稱取DPPH 20 mg，用無水乙醇溶解并定容至250 mL.測(cè)定樣液分別為木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒、抗壞血酸，將三種測(cè)定樣液均配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL的乙醇溶液.

按照表1的添加量，在具塞試管中添加反應(yīng)液，蓋塞混勻后靜置反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)0、Ai、Aj.

表1DPPH·試驗(yàn)加樣表

A樣液/mLDPPH·/mL乙醇溶液/mLA022Ai22Aj22

按下式計(jì)算清除率：

其中：Ai為DPPH·與樣品液的吸光度；Aj為樣品液與溶劑的吸光度；A0為DPPH·與溶劑的吸光度.

2.2.2 對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用[14]

采用水楊酸法測(cè)定不同質(zhì)量濃度木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒及抗壞血酸溶液對(duì)羥自由基的清除率.

配制8.8 mmol/LH2O2、9 mmol/LFeSO4以及9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液.測(cè)定樣液分別為木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒、抗壞血酸，三種測(cè)定樣液配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL.將不同質(zhì)量濃度的測(cè)定樣液與H2O2、FeSO4以及水楊酸-乙醇溶液按照表2的添加量加入到同一試管中，最后加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，于37 ℃反應(yīng)30 min，以蒸餾水作為參比液，在510 nm下測(cè)定其吸光度Ai，空白對(duì)照組以相同體積的蒸餾水代替樣液測(cè)定吸光度A0.同時(shí)考慮到樣品溶液本身的吸光值，測(cè)定以FeSO4、水楊酸-乙醇溶液、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液及蒸餾水混合溶液的吸光值作為樣品的本底吸光度Aj.

表2·OH試驗(yàn)加樣表

A樣液/mLFeSO4/mL水楊酸-乙醇/mLH2O2/mL蒸餾水/mLA02222Ai2222Aj2222

按下式計(jì)算清除率：

其中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ai為加入測(cè)定樣液后的吸光度；Aj為不加H2O2溶液的本底吸光度.

2.2.3 對(duì)超氧陰離子(O2-·)的清除作用[15]

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定不同質(zhì)量濃度木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒及抗壞血酸溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率.

配制木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒和抗壞血酸測(cè)定樣液，質(zhì)量濃度分別配制成0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL.配制0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.2)緩沖溶液、25 mmol/L鄰苯三酚溶液和8 mmol/L HCl溶液.

按表3的添加量添加0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.2)的緩沖液，在25 ℃的水浴鍋中預(yù)熱20 min，然后加入樣品溶液(質(zhì)量濃度變化范圍是0.1～0.5 mg/mL)和鄰苯三酚溶液混合均勻.將混合液置于25 ℃的水浴鍋中反應(yīng)5 min.最后加入1 mL8 mmol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng).在325 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i，樣品本底組吸光值A(chǔ)j及空白對(duì)照組吸光值A(chǔ)0.

表3超氧陰離子清除試驗(yàn)加樣表

A樣液/mLTris-HCl/mL鄰苯三酚/mL蒸餾水/mLA04.50.51Ai14.50.5Aj14.50.5

按下式計(jì)算清除率：

其中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ai為加入測(cè)定樣液后的吸光度；Aj為不加鄰苯三酚溶液的本底吸光度.

2.2.4 還原能力的測(cè)定[16]

采用鐵氰化鉀還原法測(cè)定不同質(zhì)量濃度木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒及 抗壞血酸溶液的還原能力.

將木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒、抗壞血酸配制成0.1、0.2、0.3、0.4，0.5 mg/mL質(zhì)量濃度梯度.取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.5 mL于試管中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩溶液(pH=6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液(K3Fe(CN)6)2.5 mL 置于50 ℃水浴20 min后快速冷卻，再加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液，以3 000 r/min的速度離心10 min后取5 mL上清液，依次加入4 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液(FeCl3)1 mL，充分混勻后靜置10 min，在700 nm下測(cè)其吸光度，以蒸餾水作參比溶液，吸光度值越高說明還原力越強(qiáng).

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外光譜掃描結(jié)果分析

由圖1可知，木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的最佳吸收波長為353 nm，且在353 nm處，空白固體脂質(zhì)顆粒無明顯吸收.木犀草素的最佳吸收波長為353 nm.推測(cè)木犀草固體脂質(zhì)顆粒中木犀草素的共軛體系和發(fā)色團(tuán)苯環(huán)等結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，木犀草素固體脂質(zhì)顆粒仍然保留木犀草素的結(jié)構(gòu).故選擇353nm作為檢測(cè)波長.

3.2 木犀草素固體脂質(zhì)顆粒包封率測(cè)定結(jié)果分析

3.2.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

見表4.

圖1 紫外吸收光譜圖

序號(hào)12345吸光度0.4040.4060.3990.4010.403

計(jì)算其日內(nèi)精密度的RSD=27% ，證明儀器精密度良好.

3.2.2 離心強(qiáng)度選擇結(jié)果

見表5.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在離心時(shí)間一定的條件下(4 min)，轉(zhuǎn)速為1 000 r/min時(shí)，離心率達(dá)到最大，提高轉(zhuǎn)速離心率開始無變化后呈微小下降趨勢(shì)，故選擇離心強(qiáng)度1 000 r/min.

3.2.3 離心時(shí)間選擇結(jié)果

見表6.

結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)速一定的條件下( 1 000 r/min)，離心時(shí)間為120 s時(shí)，離心率達(dá)到最大，延長離心時(shí)間，離心率下降，繼續(xù)延長離心時(shí)間，離心率無變化，故選離心時(shí)間為120 s.

表5離心強(qiáng)度的選擇數(shù)據(jù)表

離心強(qiáng)度/(r·min-1)50010001500200025003000吸光度0.1640.1840.1840.1570.1540.152木犀草素質(zhì)量比/mg12.2314.1614.1611.2711.089.44離心率/%0.510.590.590.480.470.46

表6離心時(shí)間的選擇數(shù)據(jù)表

離心時(shí)間/s306090120150180吸光度0.1530.1440.1450.1730.1510.151木犀草素質(zhì)量比/mg11.1710.3010.4013.8910.9810.98離心率/%0.460.430.430.580.460.46

3.2.4 分離度重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

見表7.

表7分離度重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

序號(hào)123平均值分離率/%59.2660.2759.8959.81

結(jié)果表明：該離心條件下的分離度接近60%.

3.2.5 紫外分光光度法測(cè)包封率

見表8.

表8紫外分光光度法測(cè)包封率

序號(hào)123平均值包封率/%74.4176.4174.2475.02

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制得的木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的包封率平均為75.02%.

3.3 木犀草素固體脂質(zhì)顆?？寡趸钚詼y(cè)定的結(jié)果與分析

3.3.1 對(duì)DPPH的清除作用

如圖2所示，在0.1～0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒、抗壞血酸對(duì)DPPH的清除率均隨樣液質(zhì)量濃度的升高而增加，三者的清除率由大到小依次為：抗壞血酸>固體脂質(zhì)顆粒>木犀草素.當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，固體脂質(zhì)顆粒的清除率達(dá)到最大值67%，接近于抗壞血酸的清除率71.6%.結(jié)果表明：木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的 DPPH 清除能力較木犀草素高，木犀草素固體脂質(zhì)顆粒有利于其抗氧化能力的發(fā)揮.

圖2 木犀草素固體脂質(zhì)顆粒對(duì)DPPH的清除作用

3.3.2 對(duì)羥自由基體系的清除作用

如圖3所示，在0.1～0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒、抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除率均隨樣液質(zhì)量濃度的升高而增加，固體脂質(zhì)顆粒的清除效果明顯高于木犀草素.由于黃酮類化合物有活潑的3，4位酚羥基，能提供活潑的氫離子，從而阻斷自由基反應(yīng).當(dāng)樣液質(zhì)量濃度低于0.3 mg/mL時(shí)，抗壞血酸清除能力與木犀草素固體脂質(zhì)顆粒相似；在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，固體脂質(zhì)顆粒的清除能力高于抗壞血酸；當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.3 mg/mL時(shí)，抗壞血酸的清除能力高于固體脂質(zhì)顆粒；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，固體脂質(zhì)顆粒的清除能力高于抗壞血酸，且木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的清除率達(dá)到最大值65%，高于抗壞血酸的清除率63%.結(jié)果表明：木犀草素和木犀草素固體脂質(zhì)顆粒均對(duì)羥自由基有一定的清除能力，且將木犀草素制備成固體脂質(zhì)顆粒明顯增加了木犀草素的抗氧化能力.

圖3 木犀草素固體脂質(zhì)顆粒對(duì)羥自由基的清除作用

3.3.3 對(duì)超氧陰離子自由基體系的清除作用

如圖4所示，在0.1～0.5mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒、抗壞血酸對(duì)超氧陰離子的清除率隨質(zhì)量濃度的升高逐漸增大，這是由于木犀草素和木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的質(zhì)量濃度升高，它們作為自由基的接受體，阻礙自由基連鎖反應(yīng)的能力也就越強(qiáng)，同時(shí)增強(qiáng)了清除自由基的能力.當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.3 mg/mL時(shí)，抗壞血酸與固體脂質(zhì)顆粒的清除率接近且明顯高于木犀草素；在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，固體脂質(zhì)顆粒的清除率高于抗壞血酸；在質(zhì)量濃度超過0.2 mg/mL后，抗壞血酸的清除率逐漸高于固體脂質(zhì)顆粒.在質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，固體脂質(zhì)顆粒的清除率達(dá)到最大值74.8%，接近于抗壞血酸的清除率78.5%.結(jié)果表明：木犀草素和木犀草素固體脂質(zhì)顆粒均具有抗氧化能力，且將木犀草素制備成固體脂質(zhì)顆粒后在一定程度上增強(qiáng)了其抗氧化能力.

圖4 木犀草素固體脂質(zhì)顆粒對(duì)超氧陰離子的清除作用

3.3.4 還原能力的測(cè)定

由圖5所示，在0.1～0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，木犀草素、木犀草素固體脂質(zhì)顆粒、抗壞血酸的還原能力隨樣液質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為0.1～0.4 mg/mL時(shí)，固體脂質(zhì)顆粒的還原能力高于抗壞血酸；當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.4 mg/mL時(shí)，抗壞血酸的還原能力高于固體脂質(zhì)顆粒；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，固體脂質(zhì)顆粒的清除率達(dá)到最大值0.81，接近于抗壞血酸的清除率0.83.木犀草素具有良好的還原能力，表明黃酮是良好的電子供應(yīng)者，并且制備成固體脂質(zhì)顆粒后，還原能力增強(qiáng).黃酮供應(yīng)的電子除還原能力外，還可以與自由基反應(yīng)生成穩(wěn)定的物質(zhì)，中斷自氧化鏈鎖反應(yīng).結(jié)果表明：木犀草素及木犀草素固體脂質(zhì)顆粒均具有還原能力，且將木犀草素制備成固體脂質(zhì)顆粒后其還原能力接近抗壞血酸.

圖5 木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的總還原能力

4 結(jié) 語

實(shí)驗(yàn)采用低速離心法將木犀草素固體脂質(zhì)顆粒與游離木犀草素分離，該方法具有操作簡便，儀器要求低等優(yōu)點(diǎn).測(cè)定的包封率結(jié)果穩(wěn)定可靠，該方法的關(guān)鍵在于離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的確定，離心速度過小活性物質(zhì)沉淀不完全，離心速度過大則固體脂質(zhì)顆粒易被沉淀，本實(shí)驗(yàn)對(duì)低速離心的條件進(jìn)行摸索，最后確定了當(dāng)離心條件為1 000 r/min、離心時(shí)間120 s時(shí)，木犀草素固體脂質(zhì)顆粒與游離木犀草素的分離效果最好，測(cè)得3批木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的包封率分別為74.41%、76.41%、74.24%.

實(shí)驗(yàn)以木犀草素和Vc作為對(duì)照，對(duì)木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的抗氧化性進(jìn)行研究，主要測(cè)定其對(duì) DPPH、 羥基自由基、 超氧陰離子和還原能力，木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的清除能力雖比Vc略低但較

木犀草素有了明顯的提高，且清除能力隨樣液質(zhì)量濃度的增加而提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL 時(shí)對(duì) DPPH 的清除率最高達(dá)到67%，當(dāng)質(zhì)量濃度為 0.5 mg/mL 時(shí)對(duì)羥自由基的清除作用超過Vc，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)對(duì)于超氧陰離子的清除率就可達(dá)到74.8%，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～0.4 mg/mL時(shí)，木犀草素固體脂質(zhì)顆粒的還原能力高于抗壞血酸.

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