李重陽，孟慶玲，喬 軍*，伍曄暉，王立霞，郭 晶，馬 帥，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州)

立克次體目為革蘭氏染色陰性、細(xì)胞內(nèi)專性寄生菌，屬于a-變形菌綱(a-Proteobacteria)。立克次體目中的立克次體屬、埃立克體屬和無形體屬的媒介主要是硬蜱，宿主為多種脊椎動(dòng)物，硬蜱叮咬是人或宿主動(dòng)物感染立克次體的主要途徑[1-4]。在臨床上，人感染立克次體表現(xiàn)為局部淋巴結(jié)病變，可有疼痛，隨后出現(xiàn)發(fā)熱和皮疹[1-2]。自1899年首次報(bào)道人落基山斑點(diǎn)熱以來，世界各地相繼發(fā)現(xiàn)20多種致病性立克次體[5]。在20世紀(jì)80年代末期，美國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)人單核細(xì)胞埃立克體病和人粒細(xì)胞埃立克體病，并從病人的血液樣本中分離到HME病原體查菲埃立克體(E.chaffeensis)和HGE的病原體嗜吞噬細(xì)胞無形體(A.phagocytophUum)[6]，引起了世界各國(guó)對(duì)無形體科及其引起的疾病的重視?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的埃立克體有5種，無形體有6種，有多個(gè)新發(fā)現(xiàn)的埃立克體和無形體尚未分類[7]。

犬感染埃立克體會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、嗜睡、厭食、黏膜蒼白、脾臟腫大、出血，并成為持續(xù)攜帶者[8]。經(jīng)蜱傳染的犬埃立克體和犬無形體是導(dǎo)致犬單核細(xì)胞埃立克體病(CME)和犬循環(huán)血小板減少癥(CCT)的病原體，也可引起人感染。自阿爾及利亞首次檢測(cè)到犬埃立克體以來，隨后在美國(guó)[9]、歐洲[10]、亞洲[11]和非洲[12]的一些國(guó)家相繼廣泛被檢測(cè)到。犬作為人類重要的伴侶動(dòng)物，分析鑒定犬立克次體的流行特點(diǎn)對(duì)于預(yù)防我國(guó)人立克次體感染有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義。因此，本研究利用PCR檢測(cè)立克次體16S rRNA基因，分析新疆石河子地區(qū)犬立克次體的感染和流行狀況。在此基礎(chǔ)上，通過遺傳進(jìn)化分析揭示立克次體，犬埃立克體及無形體石河子流行株與國(guó)內(nèi)外流行株的親緣關(guān)系，為該病的防控提供分子流行病學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DNA Marker、pMD19-T(simple)載體均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒購(gòu)買于天根(北京)生化科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自諾維森(北京)生物科技有限公司。

1.2 樣本的采集

在石河子地區(qū)采集犬體表寄生蜱655只，并在石河子市寵物醫(yī)院采集犬全血58份。樣本蜱于-20 ℃或70%酒精保存，檢測(cè)前進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，新鮮血液于4 ℃保存。

1.3 樣本DNA提取及PCR檢測(cè)

根據(jù)試劑盒說明，對(duì)采集的血液和蜱組織進(jìn)行DNA的提取，用乙醇沉淀DNA，用DD水洗脫，-20 ℃保存待檢測(cè)。然后利用特異性引物擴(kuò)增立克次體16S rRNA基因，上游引物:5'-GGTACCYACAGAAGAAGTCC-3'和下游引物：5'-TAGCACTCATCGTTTACAGC- 3'；擴(kuò)增埃立克體16S rRNA基因，上游引物：5'-TTTATCGCTATTAGATGAGCCTATG-3'和下游引物：5'-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3'。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括：5 μL DNA模板，各1 μL上下游引物，5 μL10×PCR buffer，1 μL Tap酶，4 μL dNTP mixture，滅菌去離子水加至50 μL。立克次體目的基因PCR反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性5 min；94 ℃，變性40 s；52 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸40 s；擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。犬埃立克體目的基因PCR反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性2 min；94 ℃，變性1 min；52 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸40 s；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.4 DNA序列的克隆及測(cè)序

利用PCR純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物連接到pMD19-T(simple)載體，連接體系(10 μL)：Solution I 5 μL，回收的目的片段4.5 μL，pMD19-T(simple)載體0.5 μL。連接產(chǎn)物混勻瞬時(shí)離心后于4 ℃連接過夜。將5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，然后涂在有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，在平板上挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽性克隆送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 16S rRNA基因遺傳進(jìn)化分析

利用BLAST N在線軟件，將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中注冊(cè)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。使用DNAstar8.0軟件進(jìn)行同源性分析，使用MEGA5.0 軟件通過NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap值為1000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

釆集犬體表寄生蜱655只，參照《新疆蜱類志》[13]及《中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲志》[14]，通過體式倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，為血紅扇頭蜱和俄扇頭蜱兩種，其中血紅扇頭蜱612只，俄扇頭蜱43只(圖1)。

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)PCR從采集的蜱中擴(kuò)增到52份立克次體陽性，其中俄扇頭蜱7份陽性，血紅扇頭蜱45份陽性，犬血液中沒有檢測(cè)到立克次體陽性，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，出現(xiàn)345 bp大小的條帶(圖2)，結(jié)果與預(yù)期目標(biāo)條帶分子量大小相符。使用犬埃立克體特異性引物，擴(kuò)增到87份犬埃立克體陽性，其中俄扇頭蜱15份陽性，血紅扇頭蜱72份陽性，血液中檢測(cè)到7份陽性，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，出現(xiàn)452 bp大小的條帶(圖3)，結(jié)果與預(yù)期目標(biāo)條帶分子量大小相符。同時(shí)利用此引物從蜱中檢測(cè)出無形體陽性樣本28份，血液中檢出無形體陽性3份，擴(kuò)增目的片段為452 bp(圖3)。

2.3 16S rRNA基因遺傳進(jìn)化分析

將陽性樣本送至上海生工測(cè)序，Shz-1與烏拉圭的Rickettsialesbacterium( EF687768.1)序列同源性達(dá)到99%且在同一分支，與其它Rickettsiales同源性在86.96%以上，在進(jìn)化樹分支上相距較近，提示Shz-1可能是一種立克次體新基因亞型(圖4A)。Shz-2序列與Ehrlichiasp. HF(CP007474.1)、Ehrlichiasp.Yunnan(GU227701.1)、Ehrlichiaewingii( NR_044747.1)、Ehrlichiachaffeensis(CP007480.1)同源性達(dá)到99%；與E.platysGzh981和E.canisGzh982株同源性分別為92.27%、98.89%；在進(jìn)化樹中與Ehrlichiasp. Yonaguni206(HQ697589.1)處于同一分支，和Ehrlichiasp. HF(DQ647318.1)、Ehrlichiamuris(AB013009.1)處于較近的分支；與巴西、馬來西亞半島、土耳其、馬來西亞、臺(tái)灣、日本、美國(guó)、意大利南部的Ehrlichiacanis(EF195135.1、 KR920044.1、KJ513197.1、JF429693.1、GU810149.1、AF536827.1、NR_118741.1、EU439944.1)同源性達(dá)到98.67%以上，且處于較近分支，提示Shz-2可能是一種犬埃立克體新基因亞型(圖4B)。Shz-3序列與Anaplasmasp.cloneXinjiang051-9(JX402604.1)、Anaplasmaphagocytophilum(CP006618.1、AY527213.1、GQ412337.1)同源性為99%～100%；與Anaplasma(KJ410247.1、KJ410248.1、KJ410249.1)處于同一分支，和其它A.phagocytophilum在進(jìn)化樹中處于較近分支(圖4C)。Shz-1、Shz-2、Shz-3石河子流行株用箭頭標(biāo)識(shí)。

圖3 犬埃立克體和無形體16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果M. DNA分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量；3-6.犬埃立克體陽性樣本；7.無形體陽性樣本；1-2.陰性樣本 Fig.3 Amplification of 16S rRNA genes of Ehrlichia caniand Anaplasma by PCRM. DNA Marker DL2000;3-6. Ehrlichia cani Positive samples;7. Anaplasma Positive samples;1-2. Negative samples

3 討 論

從20世紀(jì)80年代以來，在新疆陸續(xù)檢測(cè)或分離出多種蜱媒疾病病原體，包括萊姆病原體、康氏立克次體(R.conorii)、Candidatusrickettsiabarbariae、R.slovaca、R.raoulti和A.phagocytophilum等。病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)蜱攜帶立克次體有明顯差異[15]。在北疆地區(qū)，在精河的草原革婢中分離出SFGR；在瑪納斯、精河縣等地的蜱中分離出萊姆病螺旋體、SFGR并檢測(cè)出A.phagocytophilum[16]；在伊梨歷史上被證實(shí)為蜱傳斑點(diǎn)熱自然疫源地，范德生等[17]首次證實(shí)了伊犁當(dāng)?shù)厝巳貉逡约爱?dāng)?shù)丶倚篑R牛羊中都存在無形體抗體陽性；在南疆地區(qū)，在尉犁荒漠地區(qū)的短小扇頭蜱中檢出SFGR和與中央無形體(A.centrale)同源性最高的無形體[18]，在和碩地區(qū)的俄扇頭蜱中檢測(cè)出A.phagocytophilum和SFGR等[3]。在新疆博樂和塔城地區(qū)也同樣檢測(cè)到立克次體，無形體和埃立克體。

埃立克體病主要分布在美國(guó)東南部以及中南部地區(qū)[15，19]，世界上其他部分地區(qū)如墨西哥、以色列、意大利、葡萄牙、泰國(guó)、韓國(guó)、日本等證實(shí)有該病的血清陽性人群[17]。1998年，廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所獸醫(yī)研究室在廣州市郊某養(yǎng)犬基地發(fā)現(xiàn)了犬埃立克體病的流行，證實(shí)引起發(fā)病的病原為兩種埃立克體E.canis和E.platys，經(jīng)測(cè)序病原的16S rRNA并在Genbank比對(duì)后，兩株埃立克體分別命名為Gzh981(E.platys)和Gzh982(E.canis)。我國(guó)在1999年報(bào)告了首例埃立克體病例。2001年在大興安嶺地區(qū)人群血中檢測(cè)到查菲埃立克體和人粒細(xì)胞埃立克體的16S rRNA基因片段。2006年1月，在安徽宣城縣首次出現(xiàn)10例確診的無形體病例，其中一例死亡，并且證實(shí)了該病原體可以在人與人之間傳播。

圖4 立克次體、埃立克體、無形體石河子流行株16S rRNA基因遺傳進(jìn)化分析A：立克次體；B：埃立克體；C：無形體Fig.4 Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes of Rickettsia, Ehrlichia, Anaplasma A. Rickettsia; B. Ehrlichia; C. Anaplasma

石河子地處新疆北部，位于古爾班通古特沙漠邊緣，生態(tài)環(huán)境多樣，是蜱等媒介傳染病的多發(fā)地，蜱傳立克次體和犬埃立克體的傳播風(fēng)險(xiǎn)較大。由于埃立克體和無形體可引起人感染，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病的病原學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)查。本研究在655只犬體表蜱樣本和58份犬血液樣本中，蜱中檢出52份立克次體陽性樣本，占7.9%，87份埃立克體陽性樣本，占13.3%，28份無形體陽性樣本，占4.3%；血液中7份埃立克體陽性樣本，占12.1%，3份無形體陽性樣本，占5.1%。在本研究中，獲得的16S rRNA基因序列分別與GenBank中部分立克次體、埃立克體、無形體的序列同源性達(dá)到99%以上；遺傳進(jìn)化分析顯示，新疆石河子地區(qū)犬源立克次體、埃立克體及無形體流行株與國(guó)內(nèi)外流行株具有較近的親緣關(guān)系，但也存在一定的變異。近年來，隨著寵物犬?dāng)?shù)量的上升，犬作為人類重要的伴侶動(dòng)物，犬?dāng)y帶的立克次體和人類密切，因此開展犬源立克次體病的流行病學(xué)調(diào)查對(duì)于防控人立克次體的感染具有重要的意義。

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