熊小路，焦 俊，溫博海

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我國斑點熱立克次體感染與免疫的實驗研究

熊小路，焦 俊，溫博海

研究證明黑龍江立克次體能夠感染人血管內(nèi)皮細(xì)胞和BALB/c小鼠，引起小鼠菌血癥和器官損傷；全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體毒力相關(guān)基因。表面蛋白質(zhì)組分析鑒定了黑龍江立克次體和立氏立克次體的表面蛋白，用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠，發(fā)現(xiàn)某些表面蛋白為保護(hù)性抗原，并揭示這些保護(hù)性抗原均能夠誘導(dǎo)抗原特異CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖并產(chǎn)生和分泌IFN-γ和/或TNF-α，以及誘導(dǎo)高水平特異性IgG2a產(chǎn)生，在這些免疫因素的協(xié)同作用下使小鼠有效抵抗立克次體感染。用黑龍江立克次體感染Tim-3高表達(dá)或低表達(dá)人血管內(nèi)皮細(xì)胞以及Tim-3高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果有力證明Tim-3高表達(dá)能夠促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠抵抗黑龍江立克次體感染。

斑點熱立克次體；感染；免疫；保護(hù)性抗原

斑點熱立克次體通過“拉鏈?zhǔn)?(zipper-like)”入侵機(jī)制侵入非專業(yè)吞噬細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞)[1]?！袄?zhǔn)健比肭质且环N受體介導(dǎo)的入侵機(jī)制，立克次體表面配體蛋白與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合后誘導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些細(xì)胞內(nèi)信號分子在立克次體與宿主細(xì)胞相互作用部位募集肌動蛋白并重構(gòu)宿主細(xì)胞骨架，最終在立克次體周圍形成膜“拉鏈”。基于斑點熱立克次體“拉鏈?zhǔn)健比肭炙拗骷?xì)胞機(jī)制和專性胞內(nèi)寄生方式；斑點熱立克次體表面蛋白可以在立克次體的感染與免疫中發(fā)揮重要作用，比如介導(dǎo)立克次體粘附和入侵宿主細(xì)胞、促進(jìn)立克次體在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖以及誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答等[1]。近幾年來，我國學(xué)者對在我國黑龍江立克次體和立克次體中毒力最強(qiáng)的立氏立克次體在感染與免疫方面開展了系列實驗研究。

1 黑龍江立克次體的致病性

黑龍江立克次體是1982年由我國學(xué)者婁丹等分離的斑點熱立克次體新種[2]。研究人員用黑龍江立克次體感染人血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠，發(fā)現(xiàn)它與其它斑點熱立克次體相似的致病特征。同時測定黑龍江立克次體全基因組序列，通過全基因組序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)它的毒力相關(guān)基因。這些研究證明黑龍江立克次體為毒力較強(qiáng)致病菌。

1.1 感染人血管內(nèi)皮細(xì)胞 孟艷芬等[3]將人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分離，培養(yǎng)出人血管內(nèi)皮細(xì)胞，并用純化黑龍江立克次體體外感染血管內(nèi)皮細(xì)胞。感染后1～3 d，免疫熒光染色可見立克次體存在于細(xì)胞胞質(zhì)中，以游離狀態(tài)分散于胞質(zhì)內(nèi)，菌體外周有一層電子密度低的“環(huán)帶”將立克次體與宿主細(xì)胞胞質(zhì)分隔開。第5～9 d，立克次體在內(nèi)皮細(xì)胞以二分裂方式快速增殖，立克次體數(shù)量急劇增加，并且細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)立克次體。被立克次體感染細(xì)胞的胞膜形成突觸，相鄰細(xì)胞胞膜凹陷將立克次體攝入胞質(zhì)。感染后第10 d，內(nèi)皮細(xì)胞由梭形貼壁伸展生長逐漸呈瘦長形，胞質(zhì)內(nèi)充滿立克次體，細(xì)胞核內(nèi)立克次體亦有增多。感染后第12 d，大部分內(nèi)皮細(xì)胞變圓脫落；檢查脫落內(nèi)皮細(xì)胞，可見細(xì)胞內(nèi)有大量立克次體。細(xì)胞培養(yǎng)上清中也有大量立克次體，這是由于立克次體大量繁殖致細(xì)胞裂解后立克次體釋放到上清中。

1.2 感染BALB/c小鼠 段長松等[4]采用眼眶靜脈叢注射將黑龍江立克次體感染BALB/c小鼠，定量PCR檢測感染小鼠血液和肝、脾、肺、腦等主要器官中立克次體DNA拷貝數(shù)。感染后第1 d檢出少量立克次體，第3 d立克次體載量顯著增長，第6 d達(dá)到頂峰，第9 d立克次體載量顯著下降。該結(jié)果證明黑龍江立克次體能夠在BALB/c小鼠體內(nèi)建立有效的感染。另外，黑龍江立克次體感染第6 d，小鼠肺和腦組織中檢出高水平的立克次體DNA，說明立克次體擴(kuò)散到了肺和腦這兩個重要的器官，肺和腦損傷是立克次體感染致死的最重要原因。

黑龍江立克次體感染第1、3 d，小鼠的肝、脾、肺、腦組織沒有明顯病理改變。感染后第6 d，小鼠的肝、肺、腦組織出現(xiàn)明顯病理損傷：肝組織出現(xiàn)單核細(xì)胞炎性浸潤和匯管區(qū)多型核白細(xì)胞聚集以及肝細(xì)胞輕微溶脹，肺組織出現(xiàn)單個核細(xì)胞浸潤為特征的間質(zhì)性肺炎和肺泡壁增厚，腦實質(zhì)出現(xiàn)微出血點[4]。

黑龍江立克次體感染第3 d，小鼠肝、脾、肺、腦等主要器官中的IFN-γ、TNF-α和趨化因子RANTES的表達(dá)均顯著上調(diào)，說明小鼠啟動天然免疫應(yīng)答，但是器官的立克次體DNA拷貝數(shù)仍然在增加，說明天然免疫作用還比較弱，并不能有效抑制立克次體感染[4]。研究中發(fā)現(xiàn)促炎性因子IFN-γ和TNF-α的表達(dá)顯著上調(diào)與立克次體感染小鼠器官組織的炎性損傷密切相關(guān)。隨著這兩種炎性因子在器官組織中表達(dá)顯著下調(diào)，感染小鼠的器官組織損傷程度也顯著減輕。

1.3 全基因組序列分析毒力相關(guān)基因 段長松等[5-6]對黑龍江立克次體做全基因組測序，獲得一個全長1 278 471 bp的環(huán)狀基因組，該基因組含有1 333個基因，其中編碼蛋白質(zhì)的基因1 297個。將預(yù)測蛋白與毒力因子數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體有266個潛在的毒力相關(guān)蛋白，16個編碼IV型分泌系統(tǒng)蛋白。該基因組有一個基因組島，全長3 732 bp，包括7個蛋白基因。其中兩個基因編碼已知功能蛋白：一個為IV型分泌系統(tǒng)蛋白VirB1類似物，另一個為轉(zhuǎn)座酶類似物。

段長松等[6]收集了立克次體屬的43株立克次體的全基因組序列，將這些序列使用統(tǒng)一注釋系統(tǒng)進(jìn)行注釋，以去除不同注釋標(biāo)準(zhǔn)帶來的差異。分析這些統(tǒng)一注釋的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)立克次體泛基因組含有4 737個基因，其中核心基因組有693個基因。將黑龍江立克次體與立氏立克次體強(qiáng)毒株(Sheila Smith)和弱毒株(Iowa)做直系同源ORF比較，發(fā)現(xiàn)它們共享983個直系同源ORF，黑龍江立克次體獨有481個ORF。值得注意的是：黑龍江立克次體與立氏立克次體強(qiáng)毒株共享37個直系同源ORF，這些ORF為立氏立克次體弱毒株所缺失，提示這37個基因可能與黑龍江立克次體毒力密切相關(guān)[6]。

2 表面蛋白分離鑒定和發(fā)現(xiàn)新保護(hù)性抗原

2.1 表面蛋白分離鑒定 國外學(xué)者[7]采用免疫印跡和分子克隆等技術(shù)，先后鑒定了外膜蛋白(Omp)A、OmpB、Sac1、Sac2、Adr1、Adr2等斑點熱立克次體表面蛋白，并證明這些表面蛋白與斑點熱立克次體的感染與免疫密切相關(guān)[1]。齊永等[8]采用膜不通透的生物素標(biāo)記黑龍江立克次體表面蛋白，并用鏈親和素親和層析分離生物素標(biāo)記的表面蛋白，再將層析分離的表面蛋白做等電聚焦和SDS-PAGE雙向電泳，最后用串聯(lián)質(zhì)譜對電泳分離的表面蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果鑒定出黑龍江立克次體的25種表面蛋白。用立克次體感染小鼠血清和患者血清分析黑龍江立克次體重組表面蛋白芯片，發(fā)現(xiàn)多數(shù)表面蛋白為血清學(xué)反應(yīng)陽性，其中OmpA-2、OmpB-3、RpsB、SdhB等表面蛋白具有與黑龍江立克次體感染血清反應(yīng)的特異性[9]。

龔文平等[10]采用同樣方法，鑒定了立氏立克次體的10種表面蛋白。除OmpA、OmpB、GroEL、GroES、DNA-binding protein等5個蛋白在國外已經(jīng)確認(rèn)存在立氏立克次體表面外，Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4、TolC等為首次鑒定的立氏立克次體表面蛋白。采用免疫電鏡對這5種新鑒定的表面蛋白做亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)Porin_4蛋白主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)膜，其余的4種蛋白在細(xì)胞內(nèi)、外膜均有分布[10]。這些表面蛋白在細(xì)胞膜上呈點狀分布而非散在分布，這可能與其特殊的功能相關(guān)，比如吸附、運動、分子的結(jié)合及運輸?shù)取?/p>

2.2 保護(hù)性表面蛋白抗原的鑒定 國外學(xué)者[11]已經(jīng)明確的斑點熱立克次體保護(hù)性抗原僅有為OmpA和OmpB。龔文平等[10]將立氏立克次體新發(fā)現(xiàn)表面蛋白的重組蛋白免疫小鼠，用立氏立克次體攻擊免疫小鼠，最后用定量PCR檢測小鼠主要器官的立克次體載量。結(jié)果顯示Adr1、Adr2免疫小鼠的肝臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠；Adr2免疫小鼠的脾臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠；Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4免疫小鼠的肺臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠。與此相反，TolC免疫小鼠的這些器官的立克次體載量與非免疫小鼠無顯著差異[10,12]。肺為立克次體感染主要器官，Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4免疫能夠顯著減少小鼠肺部立克次體的載量，證明它們有良好的免疫保護(hù)性，為立氏立克次體保護(hù)性抗原。

齊永等[13]將黑龍江立克次體重組表面蛋白YbgF和PrsA分別免疫小鼠，再用黑龍江立克次體攻擊免疫小鼠。定量PCR檢測結(jié)果顯示YbgF免疫小鼠的立克次體載量顯著性低于PrsA免疫小鼠，而PrsA免疫小鼠的立克次體載量與非免疫小鼠無顯著差異，證明YbgF為保護(hù)性抗原。龔文平等[14]隨后也證明立氏立克次體YbgF也能誘導(dǎo)小鼠有效對抗立氏立克次體感染。另外，他還發(fā)現(xiàn)立氏立克次體外膜蛋白B片段OmpB-4與Adr2聯(lián)合免疫，它們誘導(dǎo)的特異性免疫保護(hù)效能顯著強(qiáng)于其單獨免疫[15]。另外，他們還發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體全菌抗原與Adr2聯(lián)合免疫能夠顯著增強(qiáng)Adr2的抗立氏立克次體的免疫保護(hù)效能[16]。

3 保護(hù)性抗原的免疫保護(hù)機(jī)制

3.1 激活樹突狀細(xì)胞 孟艷芬等[17]從小鼠骨髓中分離樹突狀細(xì)胞(DC)。將黑龍江立克次體4個重組OmpB(OmpB-P1、OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4)刺激DC，24 h后將DC分別腹腔接種小鼠，14 d后用黑龍江立克次體攻擊DC受體小鼠，攻毒7d后用定量PCR檢查小鼠臟器的立克次體載量。結(jié)果顯示OmpB-P2、OmpB-P3或OmpB-P4刺激DC的受體小鼠的立克次體載量顯著低于非抗原刺激DC的受體小鼠或OmpB-P1刺激DC的受體小鼠。該結(jié)果提示OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4激活DC能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗黑龍江立克次體免疫應(yīng)答，而OmpB-P1激活DC則不能。

采用磁珠分選技術(shù)將抗原激活DC的受體小鼠脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞分離，再將CD4+和CD8+T細(xì)胞分別與同源抗原刺激DC在體外相互作用24 h，然后用流式細(xì)胞儀檢測CD4+和CD8+T細(xì)胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4表達(dá)。結(jié)果顯示OmpB-P2、OmpB-P3和OmpB-P4激活DC均能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，其中IFN-γ水平顯著高于OmpB-P1激活DC作用的CD4+T細(xì)胞。另外還發(fā)現(xiàn)OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4激活DC均能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，其水平顯著高于OmpB-P1刺激DC作用的CD8+T細(xì)胞[17]。這些提示立克次體保護(hù)性抗原激活的DC能夠誘導(dǎo)抗原特異的CD4+和 CD8+T細(xì)胞高效表達(dá)IFN-γ和TNF-α，使它們分別向Th1細(xì)胞和Tc1細(xì)胞分化，產(chǎn)生有效的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[17]。

3.2 激活體液免疫應(yīng)答 齊永等[13]比較黑龍江立克次體YbgF和PrsA誘導(dǎo)小鼠的特異性體液免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)雖然這兩個蛋白都有能力誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG抗體，但是保護(hù)性抗原YbgF免疫血清抑制立克次體入侵人血管內(nèi)皮細(xì)胞能力顯著強(qiáng)于非保護(hù)性抗原PrsA免疫血清。同樣，龔文平等[10,12]發(fā)現(xiàn)立氏立克次體保護(hù)性抗原免疫血清能夠顯著抑制立氏立克次體侵入人血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些結(jié)果提示這些保護(hù)性表面蛋白抗原的特異性抗體可以與立克次體表面相應(yīng)抗原結(jié)合，從而阻止其對人血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和入侵。

國外研究[18]發(fā)現(xiàn)IgG2a抗體的Fc部分可以與補(bǔ)體相互作用并激活巨噬細(xì)胞的Fc受體，誘導(dǎo)Fc受體介導(dǎo)的免疫效應(yīng)，其中包括激活抗體依賴的細(xì)胞毒作用和調(diào)理巨噬細(xì)胞的吞噬作用。齊永[13]和龔文平等[12]研究證明這些保護(hù)性抗原均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG2a，而非保護(hù)性抗原則不能。

3.3 激活細(xì)胞免疫應(yīng)答 齊永等[13]發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體保護(hù)性抗原YbgF能特異性誘導(dǎo)感染小鼠CD4+T細(xì)胞顯著增殖和TNF-α分泌。龔文平等[12]用立氏立克次體保護(hù)性抗原Adr2體外刺激立氏立克次體感染小鼠的CD4+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該CD4+T細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ的水平顯著高于Adr2刺激的非感染小鼠CD4+T細(xì)胞。另外，Adr2刺激的感染小鼠CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-6的水平顯著高于Adr2刺激的非感染小鼠CD8+T細(xì)胞。

王穎等[19]在體外將人單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為樹突狀細(xì)胞(HMDCs)，發(fā)現(xiàn)保護(hù)性抗原激活的HMDCs能夠誘導(dǎo)人CD4+和 CD8+T細(xì)胞激活并表達(dá)高水平IFN-γ和TNF-α，驅(qū)使CD4+和 CD8+T細(xì)胞分別朝著Th1 和 Tc1 極化。熊小路等[20]發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體保護(hù)性蛋白抗原的Th1表位肽混合免疫能夠有效激活小鼠CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答對抗貝氏柯克斯體感染，提示保護(hù)性抗原的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位在誘導(dǎo)抗立克次體的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。

4 Tim-3增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞殺立克次體效能

T細(xì)胞免疫球蛋白和粘附分子-3 (Tim-3)最初被認(rèn)為是Th1細(xì)胞的特異性受體，它通過調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的功能，維持免疫平衡和免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也在多種免疫活性細(xì)胞表達(dá)，包括斑點熱立克次體的宿主細(xì)胞—血管內(nèi)皮細(xì)胞。

楊小梅等[21]用黑龍江立克次體感染C3H/HeN小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)立克次體感染3 d內(nèi)，小鼠脾臟立克次體數(shù)量隨著感染時間延長而逐漸增加，Tim-3 mRNA表達(dá)水平則逐漸下降。用黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，立克次體載量與Tim-3 mRNA表達(dá)水平也呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)、外實驗結(jié)果一致證明Tim-3參與了立克次體感染早期的免疫應(yīng)答。

楊小梅等[21]使用小鼠Tim-3胞外段與人IgG1-Fc的融合蛋白阻斷小鼠的Tim-3信號通路。結(jié)果顯示小鼠脾臟的立克次體載量明顯增多，小鼠外周血中抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-18)和趨化因子RANTES表達(dá)水平明顯下降。該結(jié)果提示，Tim-3信號通路的阻斷能夠抑制宿主的抗立克次體免疫應(yīng)答。用黑龍江立克次體感染Tim-3高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，感染后第3 d發(fā)現(xiàn)該小鼠無明顯感染表現(xiàn)，而野生型對照小鼠的感染則非常明顯，另外Tim-3高表達(dá)小鼠的抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠。這些說明Tim-3高表達(dá)能夠增強(qiáng)宿主抗立克次體的免疫應(yīng)答。

楊小梅等[21]用黑龍江立克次體感染用Tim-3-人IgG1-Fc融合蛋白封閉了Tim信號通路的血管內(nèi)皮細(xì)胞，感染3 d后發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞內(nèi)立克次體數(shù)量顯著多于對照細(xì)胞，提示Tim-3信號通路的阻斷能夠降低血管內(nèi)皮細(xì)胞殺立克次體的效能。用黑龍江立克次體感染穩(wěn)定高表達(dá)或低表達(dá)Tim-3的血管內(nèi)皮細(xì)胞，3 d后發(fā)現(xiàn)Tim-3高表達(dá)細(xì)胞的立克次體數(shù)量顯著低于對照細(xì)胞，而Tim-3低表達(dá)細(xì)胞的立克次體數(shù)量顯著高于對照細(xì)胞。這些說明Tim-3高表達(dá)能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞殺立克次體作用，而抑制Tim-3表達(dá)或阻斷Tim-3信號通路則能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗立克次體相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而降低血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷胞內(nèi)立克次體的效能。

楊小梅等[21]還發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體感染3 d后，無論是阻斷Tim-3信號通路還是降低Tim-3表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，其一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)水平和IFN-γ mRNA表達(dá)水平顯著下降。國外研究已經(jīng)證明IFN-γ能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增加NO合成去殺傷胞內(nèi)菌，因此該結(jié)果提示Tim-3表達(dá)下降或Tim-3信號通路阻斷能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的IFN-γ mRNA表達(dá)，進(jìn)而減少iNOS表達(dá)和NO合成去降低血管內(nèi)皮細(xì)胞殺立克次體的效能。另外，黑龍江立克次體感染3 d后，Tim-3高表達(dá)小鼠的脾臟IFN-γ和TNF-α以及iNOS mRNA表達(dá)水平均顯著高于野生型小鼠，而脾臟內(nèi)立克次體數(shù)量則顯著低于野生型小鼠。這些說明Tim-3高表達(dá)和Tim-3信號通路激活能夠上調(diào)宿主和宿主細(xì)胞IFN-γ和TNF-α表達(dá)，進(jìn)而增加iNOS表達(dá)和NO合成去殺傷胞內(nèi)、外的立克次體。

5 結(jié) 語

近年來，研究證明我國分離的黑龍江立克次體為毒力較強(qiáng)的致病菌，測定了黑龍江立克次體和立氏立克次體表面蛋白質(zhì)組并發(fā)現(xiàn)了新保護(hù)性抗原，同時研究證明這些保護(hù)性抗原能夠誘導(dǎo)抗原特異CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖并產(chǎn)生高水平IFN-γ和/或TNF-α，以及誘導(dǎo)高水平特異性IgG2a，在這些免疫因素的協(xié)同作用下使機(jī)體能夠有效抵抗立克次體感染。另外，研究首次證明Tim-3高表達(dá)和Tim-3信號通路激活能夠增強(qiáng)宿主和宿主細(xì)胞—血管內(nèi)皮細(xì)胞清除立克次體感染的能力。

未來將研究表面蛋白在斑點熱立克次體與宿主細(xì)胞相互作用中所扮演角色，以及它們對宿主細(xì)胞Tim-3信號通路的影響，并鑒定保護(hù)性表面蛋白抗原的CD4+和CD8+T細(xì)胞表位。通過這些研究，將進(jìn)一步闡明斑點熱立克次體的分子致病機(jī)制，研發(fā)出有效的斑點熱分子疫苗，并為斑點熱的治療提供新思路。

[1] Chan YG, Riley SP, Martinez JJ. Adherence to and invasion of host cells by spotted fever group rickettsia species[J]. Front Microbiol, 2010, 1: 139.

[2] Lou D, Wu YM, Wang B, et al. The isolation and identification of Rickettsia heilongjiangensis, a new member of spotted fever group[J]. Chin J Microbiol Immunol,1985, 7(5): 250-253. (in Chinese)

婁丹，吳益民，王冰，等. 斑點熱立克次體的一個新成員—黑龍江立克次體分離鑒定[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1985,7(5):250-253.

[3] Meng YF, Duan CS, Wang XL, et al. Primary study onRickettsiaheilongjiangensisinfection of vascular endothelial cells[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(6): 6-10. (in Chinese)

孟艷芬, 段長松, 王錫樂,等. 黑龍江立克次體感染血管內(nèi)皮細(xì)胞的初步研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報. 2011，27(6): 6-10.

[4] Duan C, Meng Y, Wang X, et al. Exploratory study on pathogenesis of far-eastern spotted fever[J]. Am J Trop Med Hyg, 2011, 85(3): 504-509.

[5] Duan C, Tong Y, Huang Y, et al. Complete genome sequence ofRickettsiaheilongjiangensis, an emerging tick-transmitted human pathogen[J]. J Bacteriol, 2011, 193(19): 5564-5565.

[6] Duan C, Xiong X, Qi Y, et al. Genomic and comparative genomic analyses ofRickettsiaheilongjiangensisprovide insight into its evolution and pathogenesis[J]. Infect Genet Evolut, 2014, 26: 274-282.

[7] Renesto P, Samson L, Ogata H, et al. Identification of two putative rickettsial adhensins by proteomic analysis[J]. Res Microbiol, 2006, 157, 7: 605-612.

[8] Qi Y, Xiong X, Wang X, et al. Proteome analysis and serological characterization of surface-exposed proteins ofRickettsiaheilongjiangensis[J]. PLoS ONE, 2013, 8(7): e70440.

[9] Qi Y, Gong Y, Xiong X, et al. Microarray of surface-exposed proteins of rickettsia heilongjiangensis for serodiagnosis of Far-eastern spotted fever[J]. BMC Infect Dis, 2014, 14: 332.

[10] Gong W, Xiong X, Qi Y, et al. Identification of novel surface-exposed proteins ofRickettsiarickettsiiby affinity purification and proteomics[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e100253.

[11] Feng HM, Whitworth T, Olano JP, et al. Fc-dependent polyclonal antibodies and antibodies to outer membrane proteins A and B, but not to lipopolysaccharide, protect SCID mice against fatalRicketssiaconoriiinfection[J]. Infect Immun, 2004, 72(4): 2222-2228.

[12] Gong W, Xiong X, Qi Yong, et al. Surface protein Adr2 ofRickettsiarickettsiiinduced protective immunity against Rocky Mountain spotted fever in C3H/HeN mice[J]. Vaccine, 2014, 32: 2027-2033

[13] Qi Y, Xiong X, Duan C, et al. Recombinant protein YbgF induces protective immunity againstRickettsiaheilongjiangensisinfection in C3H/HeN mice[J]. Vaccine, 2013, 31: 5643-5650

[14] Gong W, Qi Yong, Xiong X, et al. TheRickettsiarickettsiiouter membrane protein YbgF induces protective immunity in C3H/HeN mice[J]. Human Vaccines Immunotherapeutics, 2015, 11(3): 642-649.

[15] Gong W, Wang P, Xiong X, et al. Enhanced protection againstRickettsiarickettsiiinfection in C3H/HeN mice by immunization with a combination of a recombinant adhesin rAdr2 and a protein fragment rOmpB-4 derived from outer membrane protein B[J]. Vaccine, 2015, 33: 985-992.

[16] Gong W, Wang P, Xiong X, et al. Chloroform-methanol residue ofCoxiellaburnetiimarkedly potentiated the specific immunoprotection elicited by a recombinant protein fragment rOmpB-4 derived from outer membrane protein B ofRickettsiarickettsiiin C3H/HeN mice[J]. PLoS One, 2015, 10(4): e0124664.

[17] Meng Y, Xiong X, Qi Y, et al. Protective immunity againstRickettsiaheilongjiangensisin a C3H/HeN mouse model mediated by outer membrane protein B-pulsed dendritic cells[J]. Sci China Life Sci, 2015, 58(3): 287-296.

[18] Mansueto P, Vitale G, Cascio A, et al. New insight into immunity and immunopathology of rickettsial diseases, clinical and developmental immunology[J]. Clin Dev Immunol, 2012, 2012: 967852.

[19] Wang Y, Xiong X, Wu D, et al. Efficient activation of T cells by human monocyte-derived dendritic cells (HMDCs) pulsed withCoxiellaburnetiiouter membrane protein Com1 but not by HspB-pulsed HMDCs[J]. BMC Immunol, 2011, 12: 52.

[20] Xiong X, Qi Y, Gong W, et al. Exploratory study on Th1 epitope-induced protective immunity againstCoxiellaburnetiiinfection[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e87206.

[21] Yang X, Jiao J, Han J, et al. Enhanced expression of T-cell immunoglobulin and mucin domain protein 3 in endothelial cells facilitates intracellular killing ofRickettsiaheilongjiangensis[J]. J Infect Dis, 2016, 213: 71-79.

Experimental studies on infection and immunity of spotted fever group rickettsiae in China

XIONG Xiao-lu, JIAO Jun, WEN Bo-hai

(StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

Studies showed thatRickettsiaheilongjiangensiscould infect human vascular endothelial cells (ECs) and BALB/c mice, causing bacteremia and organ damage in mice; whole genomic sequence assay revealed the virulence-associated genes ofR.heilongjiangensis. The study of surface proteome identified the surface proteins ofR.heilongjiangensisandR.rickettsii. By immunization of C3H/HeN mice with the surface proteins, several protective antigens were determined, which could efficiently induce proliferation and secretion of IFN-γ and/or TNF-α of in CD4+and CD8+T cells and elicited production of IgG2a in B cells, by which, the rickettsial organisms were eradicated in mice. We usedR.heilongjiangensisto infect ECs with low expression of Tim-3 and overexpressed Tim-3 or mice with overexpressed Tim-3, our results strongly demonstrated that enhanced Tim-3 expression could inhibit rickettsial growth, bothinvivoin mice andinvitroin ECs.

spotted fever group rickettsiae; infection; immunity; protective antigen

Wen Bo-hai, Email: bohaiwen@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.013

國家自然科學(xué)基金(No.31470894)

溫博海，Email: bohaiwen@sohu.com

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

R376

A

1002-2694(2016)10-0917-05

2016-05-09；

2016-08-17

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31470894)