丁靜美,鄧凱東,張 蓉,馬 濤,刁其玉,成述儒,周麗雪,屠 焰*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100081； 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070; 3.金陵科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038)

反芻動(dòng)物采食飼料后通過瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生甲烷，不僅造成能量的浪費(fèi)，還引起溫室效應(yīng)。因此，甲烷減排一直是研究的熱點(diǎn)[1]。甲烷產(chǎn)生與瘤胃pH、氨態(tài)氮(NH3-N)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等瘤胃發(fā)酵參數(shù)密切相關(guān)[2-4]。而瘤胃發(fā)酵參數(shù)與飼糧的采食時(shí)間、飼糧的品質(zhì)有關(guān)[3]，所以甲烷排放可能與采食時(shí)間有關(guān)。研究表明,適當(dāng)提高飼糧中精料水平不僅可以提高飼料的利用率，可降低甲烷的排放量。多數(shù)研究都集中在飼糧NFC/NDF對(duì)山羊[5]、奶牛[6]、肉牛等[7]瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，劉潔[8]在肉羊中僅研究飼糧NFC/NDF與瘤胃參數(shù)之間的關(guān)系,趙一廣[9]明確了肉用綿羊甲烷排放與瘤胃液pH、乙酸占總揮發(fā)酸(TVFA)的比例間的線性關(guān)系，但并未闡明甲烷排放的規(guī)律,尤其是不同時(shí)間點(diǎn)甲烷排放量規(guī)律的研究。因此，本研究通過測定不同時(shí)間點(diǎn)瘤胃液瘤胃發(fā)酵參數(shù)及甲烷產(chǎn)量，旨在通過瘤胃發(fā)酵參數(shù)研究甲烷排放規(guī)律，為成年肉羊甲烷排放提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)于2016年5月至2016年8月在北京昌平區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地完成。選用12只安裝永久瘤胃瘺管的杜泊×小尾寒羊雜交羯羊(50.9±2.8) kg，清晨空腹稱重后，佩戴耳標(biāo)和進(jìn)行除蟲處理后，隨機(jī)分成4組，每組3只。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

采用4×4完全拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)。共進(jìn)行4期試驗(yàn)，每期4個(gè)試驗(yàn)處理。每期試驗(yàn)中， 各處理組飼喂NDF與NFC比例分別為3.6、2.7、1.7、1.05的全混合飼糧，飼糧以玉米秸稈為粗飼料、玉米和豆粕為精飼料原料。飼糧成分及營養(yǎng)成分見表1。

每期試驗(yàn)持續(xù)23 d(包括10 d預(yù)飼期和13 d正式期)。試驗(yàn)羊均按維持水平飼喂，本試驗(yàn)在維持體重的情況下進(jìn)行飼喂，本試驗(yàn)在維持體重的情況下進(jìn)行飼喂，在正式試驗(yàn)前，根據(jù)NRC(2007)《綿羊飼糧標(biāo)準(zhǔn)》[10]中的單倍維持需要量進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，當(dāng)每只羊體重基本保持不變時(shí)確定為飼喂量，每日飼喂兩次(08:00和16:30)，自由飲水。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis)

注：①維生素添加劑為每千克飼糧提供：VA 15 000 IU, VD 5 000 IU, VE 50 mg；②微量元素添加劑為每千克飼糧提供: Fe 90 mg, Cu 12.5 mg, Mn 130 mg, Zn 100 mg, Se 0.3 mg, I 1.5 mg, Co 0.5 mg；③NFC為計(jì)算值, 其他營養(yǎng)水平均為實(shí)測值 NFC=100-(NDF + CP +EE + ash)[11]。

Notes:①Provided per kg of TMR: VA 15000IU, VD 5000IU, VE 50 mg;②Provided per kg of TMR: Fe 90 mg, Cu 12.5 mg, Mn 130 mg, Zn 100 mg, Se 0.3 mg, I 1.5 mg, Co 0.5 mg;③Nutrient levels are measured values, except for ME and NFC, NFC=100-(NDF + CP +EE + ash)[11].

1.3 測定項(xiàng)目

1.3.1 甲烷排放量 在每期試驗(yàn)正式期的第1～12天進(jìn)行氣體代謝試驗(yàn)：在第1、4和6天分3批(4只羊/批，每處理1只)將試驗(yàn)羊分別移入4個(gè)呼吸代謝室內(nèi)，適應(yīng)24 h后，測定隨后48 h內(nèi)每只羊的甲烷日產(chǎn)量，利用Sable系統(tǒng)連接的呼吸代謝箱進(jìn)行測定CH4、CO2排放量(GGA，Los Gatos Research，California，USA)及O2的消耗量(FC-10氧氣測定儀，Sable Systems International，Henderson，NV，USA)[12]。

1.3.2 瘤胃液pH、NH3-N和VFA 每期試驗(yàn)正試期第13天的8：00、10:00、12:00、14:00和16:00，分別通過每只羊的瘤胃瘺管，用200 mL注射器連接一段塑料軟管插入瘤胃食糜中，采集約 50 mL 瘤胃液，用便攜式電子pH計(jì)(Testo-206，TESTO Industry Corp.,德國)，立即測定瘤胃液pH，隨后用滅菌的四層紗布過濾瘤胃液，濾液置于-20 ℃保存，用于檢測VFA和NH3-N。NH3-N采用苯酚-次氯酸鈉比色法[13]測定；VFA參照Cao的方法[14]，采用氣相色譜儀(GC-128，上海儀電分析儀器有限公司，上海，中國)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)物為2-EB。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的一般線性分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行有重復(fù)值的方差分析，各時(shí)間點(diǎn)均值采用contrasts進(jìn)行多重比較。統(tǒng)計(jì)分析的顯著性水平為0.05，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃液pH

表2為不同NDF/NFC飼糧對(duì)瘤胃液pH的影響。隨著NDF/NFC比例的降低，飼糧4瘤胃pH在飼喂后0 h顯著低于其他三種飼糧(P<0.05)，其他三種飼糧間差異不顯著(P>0.05)；在飼喂后6～8 h內(nèi)，飼糧1顯著高于其他三種飼糧(P<0.05)。隨著飼喂時(shí)間的變化，各飼糧間瘤胃pH呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。飼糧1、2在飼喂4 h后pH顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)，而飼糧3、4在飼喂2 h后pH顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。

2.2 瘤胃液NH3-N

從表3知，在飼喂后的同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)隨著NDF/NFC比例的降低，瘤胃NH3-N逐漸升高。在飼喂后0 h內(nèi)，四種飼糧之間差異極顯著(P<0.05)；飼喂后4 h、6 h、8 h內(nèi)，飼糧1的NH3-N顯著低于其他三種飼糧(P<0.05)。隨著時(shí)間的變化，NH3-N呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，飼喂2 h后，飼糧1、2和3的NH3-N顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。而飼糧4在0 h時(shí)，NH3-N的濃度顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。

2.3 瘤胃液VFA

從表4知，總揮發(fā)酸是各脂肪酸濃度值相加的結(jié)果，然后計(jì)算各酸占總揮發(fā)酸的比例。乙酸占TVFA的比例在飼喂后0、4、8 h后，飼糧1顯著高于其他三種飼糧(P<0.05)；丁酸在飼喂0、2 h 內(nèi)，飼糧4顯著高于其他三種飼糧(P<0.05)。乙酸/丙酸在飼喂4 h后，飼糧1顯著高于其他三種飼糧(P<0.05)。隨著時(shí)間點(diǎn)的變化，各時(shí)間點(diǎn)的乙酸、丙酸以及丁酸的變化不顯著(P>0.05),但是乙酸/丙酸呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢，四種飼糧的0 h顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。

表2 不同 NDF/NFC飼糧對(duì)各時(shí)間點(diǎn)瘤胃液pH的影響Table 2 Effect of different NDF/NFC dietary on the pH of rumen liquid at different time

注：a,b,c,d：同行均值帶不同肩標(biāo)差異顯著(P<0.05)。A,B,C,D:同列均值帶不同肩標(biāo)差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes:a,b,c,d: In the same row, values with different superscripts differ significantly (P<0.05). A,B,C,D: In the same column, values with different superscripts differ significantly (P<0.05). The same below.

表3 不同 NDF/NFC飼糧對(duì)各時(shí)間點(diǎn)瘤胃液NH3-N(mg/100 mL)的影響Table 3 Effects of different NDF/NFC dietary on ruminal concentrations of NH3-N (mg/100 mL) at different time

表4 不同NDF/NFC飼糧對(duì)各時(shí)間點(diǎn)瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸的影響Table 4 Effect of different NDF/NFC dietary on ruminal concentrations of volatile fatty acids at different time

2.4 甲烷排放

從表5知，隨著NDF/NFC比例的降低，飼喂后0～2 h、2～4 h、7～8 h內(nèi)，飼糧4的甲烷排放量均顯著低于其他三種飼糧(P<0.05)。隨著時(shí)間的變化，甲烷排放量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。在飼喂后0～2 h內(nèi)，四種飼糧均甲烷排放量顯著高于其他時(shí)間段(P<0.05)。

表5 飼糧NDF/NFC對(duì)甲烷排放量(L/2 h)的影響Table 5 Effect of different NDF/NFC dietary on methane emission (L/2 h)

3 討 論

3.1 飼糧NFC/NDF對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH是衡量瘤胃發(fā)酵的一個(gè)最直觀指標(biāo)，它受到唾液分泌、VFA等影響，其波動(dòng)的根本原因就是飼糧結(jié)構(gòu)的改變和采食時(shí)間的變化[15]。本研究中，NDF/NFC為1.05的飼糧pH顯著低于NDF/NFC為3.6、2.70、1.75的飼糧。與劉潔[8]、趙國琦[15]的結(jié)果一致。同時(shí)，隨著采食時(shí)間的推移，本研究結(jié)果表明各處理組的飼糧瘤胃pH呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，與韓昊奇等[5]研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)榱鑫赣袡C(jī)物的降解產(chǎn)生有機(jī)酸從而降低瘤胃pH。對(duì)于瘤胃液pH隨著NDF的降低而降低的原因，一是NFC比例升高，能夠產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，從而pH逐漸降低；二是NDF含量降低，動(dòng)物反芻次數(shù)相應(yīng)減少，與有機(jī)酸中和的唾液也隨著減少，pH降低[5]。

瘤胃液NH3-N也是衡量瘤胃發(fā)酵的指標(biāo)，它是飼料蛋白質(zhì)降解率和微生物利用效率的綜合結(jié)果，在一定程度上反映了瘤胃微生物分解含氮物質(zhì)及其利用情況。本研究結(jié)果顯示，隨著NDF/NFC為1.05的瘤胃NH3-N顯著高于NDF/NFC為3.6、2.70、1.75的飼糧，與周永康等[17]、林淼等[18]的研究結(jié)果一致。因?yàn)殡S著NDF水平的降低、NFC的比例升高，更多的物質(zhì)增強(qiáng)了微生物的活性和對(duì)蛋白質(zhì)的降解的能力。同時(shí)NH3-N在酸性環(huán)境下形成NH4+固定起來，不被瘤胃壁吸收，所以隨著NDF水平的降低，pH逐漸降低，從而NH3-N濃度顯著升高。同時(shí)隨著飼喂時(shí)間的變化，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在2 h時(shí)達(dá)到最低值。這與劉潔[8]的研究一致。主要是因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，微生物降解的蛋白質(zhì)逐漸減少，更多的NH3-N被用于合成菌體蛋白。

揮發(fā)性脂肪酸是衡量瘤胃發(fā)酵的另一項(xiàng)指標(biāo)。反芻動(dòng)物機(jī)體70%～80%的可消化能來自于揮發(fā)酸，是反芻動(dòng)物賴以生存、保證正常活動(dòng)的主要能源來源，參與機(jī)體的各種代謝[19]。飼糧中的碳水化合物經(jīng)過瘤胃微生物的發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等一些短鏈揮發(fā)性脂肪酸，因此，瘤胃的發(fā)酵類型受到飼糧的類型的影響[20]。前人研究表明，隨著飼糧中NFC比例的升高，總TVFA也隨之升高，乙酸、乙酸/丙酸的比例逐漸降低，丙酸的比例逐漸升高[10]。但是本試驗(yàn)總VFA不受飼糧NDF/NFC的影響，與Lascano和Kljak[21]研究一致。NDF/NFC為1.05飼糧乙酸、乙酸/丙酸的比例顯著低于其他三種飼糧，丙酸的比例顯著高于其他三種飼糧，可以推出瘤胃發(fā)酵模式由乙酸模式進(jìn)丙酸模式。本試驗(yàn)在維持飼喂水平進(jìn)行，隨著NDF水平降低，綿羊的采食量逐漸降低，發(fā)酵底物減少，TVFA降低，而丙酸、丁酸的含量增加，可以說明機(jī)體合成更多的能量用于代謝，減少甲烷的產(chǎn)生，提高飼料的利用效率。

3.2 飼糧NDF/NFC對(duì)肉羊甲烷排放的影響

反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)酵罐，它能夠?qū)?dòng)物采食的植物纖維等碳水化合物轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸，進(jìn)而在甲烷菌的作用下生成甲烷以噯氣的形式排出體外。研究表明，甲烷排放與飼糧的營養(yǎng)水平[1]、時(shí)間的變化有關(guān)。馬燕芬等[22]利用Sable系統(tǒng)控制的呼吸頭箱測定計(jì)算奶山羊24 h內(nèi)的甲烷排放量，發(fā)現(xiàn)在飼喂后0～3 h內(nèi)，甲烷排放量最高。Mathers 和Walters[23]在飼喂肉羊的2 h后，碳水化合物的發(fā)酵速率隨著時(shí)間的變化差距很大，并且甲烷排放量在飼喂后30 min后達(dá)到最高，直到下一次飼喂時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高。本研究隨著飼喂后時(shí)間的推移，甲烷排放量、瘤胃發(fā)酵參數(shù)pH、各種揮發(fā)酸的比例均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，在飼喂后2內(nèi)，甲烷排放量最高。這說明反芻動(dòng)物采食后，飼料在瘤胃開始發(fā)酵，產(chǎn)生大量的CH4，然后通過反芻，將氣體以噯氣的形式排除體外，隨著時(shí)間的推移，飼料可發(fā)酵量逐漸減少，則產(chǎn)氣量逐漸降低。Aguerre等[24]、趙一廣[9]結(jié)果表明隨著精料水平的升高，瘤胃pH液、揮發(fā)酸與甲烷產(chǎn)量成線性正相關(guān)。本試驗(yàn)的結(jié)果在同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)甲烷排放量隨著飼糧NDF/NFC比例的降低有降低的趨勢，但是甲烷排放量與瘤胃液pH、乙酸占總揮發(fā)酸的比例線性不顯著(P= 0.22,0.192)?？赡苁且?yàn)楦淄榕欧诺男视嘘P(guān)，即在可發(fā)酵的有機(jī)物的基礎(chǔ)上，甲烷排放量跟飼糧NDF/NFC的比例以及瘤胃pH、乙酸占總揮發(fā)酸的比例有關(guān)。研究表明，飼糧可發(fā)酵有機(jī)物的影響甲烷排放最主要的途徑是影響瘤胃液pH，進(jìn)而影響瘤胃微生物區(qū)系[25]。在維持水平，本試驗(yàn)還要對(duì)單位可發(fā)酵有機(jī)物的甲烷排放、瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)一步研究。

甲烷的排放量不僅與瘤胃發(fā)酵參數(shù)有關(guān)系，還與動(dòng)物的品種、環(huán)境有關(guān)。飼喂量越多，則甲烷排放量逐漸升高，但是會(huì)降低飼料的利用率?？梢赃m當(dāng)?shù)慕档惋曃沽?，采取少喂勤添的方式，則可相對(duì)降低瘤胃的甲烷的產(chǎn)量，提高飼糧的利用率，增加飼料的轉(zhuǎn)化率。

4 結(jié) 論

在維持飼喂水平，基于瘤胃發(fā)酵參數(shù)和不同時(shí)段內(nèi)甲烷排放數(shù)據(jù)，NDF/NFC比例為1.05的飼糧在0、6、8 h內(nèi)瘤胃較低，乙酸占總揮發(fā)酸的比例低，甲烷排放量較少。在維持飼糧水平，甲烷排放量隨著瘤胃發(fā)酵參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化而變化，動(dòng)物在采食后0～2 h內(nèi)，甲烷排放量最高。

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