劉 睿 李亞榮

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤血液科，長(zhǎng)春 130012)

1 CAR-T的發(fā)展歷程及現(xiàn)階段臨床應(yīng)用

1890年COLEY毒素的治療拉開了腫瘤免疫治療序幕，20世紀(jì)50年代，Burnet等闡釋了免疫監(jiān)視學(xué)說(shuō)，指出腫瘤的形成是免疫逃逸的結(jié)果。2002年，Dunn等[1]在此基礎(chǔ)上提出了腫瘤的免疫編輯學(xué)說(shuō)。提出細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)在腫瘤的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。特異性抗原(如腫瘤細(xì)胞表面抗原)經(jīng)抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)的攝取、加工、提呈后，與MHCⅠ類抗原形成MHC-抗原肽復(fù)合物。此種復(fù)合物與CTL的特異性識(shí)別受體(T cell receptor，TCR)結(jié)合后，從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫應(yīng)答。而腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌VEGF、TF-P、IL-10等細(xì)胞因子，以及下調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC類分子或T細(xì)胞活化所需共刺激分子的表達(dá)，阻止了APC的成熟分化，干擾正常呈遞過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了免疫逃逸[2]?？乖逗鲜荏wT細(xì)胞(CAR-T)通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使T細(xì)胞表面表達(dá)靶細(xì)胞的抗原受體，以抗原特異性的方式和非HLA依賴的方式識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原并有效殺傷靶細(xì)胞[3]。

2 抗原嵌合受體T細(xì)胞(CAR-T)的主要結(jié)構(gòu)

抗原嵌合受體主要由四部分組成，包括細(xì)胞外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)[4]?？乖Y(jié)合區(qū)由識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor associated antigen，TAA)的特異性單克隆單鏈抗體(single chain Fv domain,scFv)構(gòu)成，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷[5]。鉸鏈區(qū)(也被稱為間隔區(qū))由CD8、CD28或IgGFc段構(gòu)成，這一結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了T細(xì)胞表面的抗原結(jié)合域。跨膜區(qū)由Ⅰ型跨膜蛋白(如CD4、CD8、CD28等)形成的跨膜序列組成。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)主要由0～2個(gè)活化T細(xì)胞所需的共刺激分子[如:CD28、CD-134(OX40),CD137]以及CD3ζ構(gòu)成，主要負(fù)責(zé)激活下游信號(hào)通路，引起T細(xì)胞的增殖和活化[6]。CAR-T的結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了如下四代變革。1988年，F(xiàn)inney等[7]構(gòu)建了第一代CAR-T，主要由scFv與胞內(nèi)單一信號(hào)分子CD3ζ構(gòu)成。一代CAR-T與靶抗原結(jié)合后，使CD3ζ鏈的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosinebas-ed activating motif,ITAM)磷酸化，與胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶(PTK)Zap-70結(jié)合從而啟動(dòng)TCR，使T細(xì)胞停留在G-G1期。但因缺乏共刺激分子的協(xié)助無(wú)法活化，故不能進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤功能。

隨后，研究人員在一代CAR-T的基礎(chǔ)上加入了1個(gè)共刺激分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域，研究最廣泛的共刺激分子是CD28。Barbara等[8]的研究證明含有CD28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力和持久性。Maher等[9]的實(shí)驗(yàn)證明含有CD28的前列腺特異性膜抗原(PSMA)二代CAR與第一代抗PSMA CAR相比，能釋放更多的IL-2因子，引發(fā)更強(qiáng)的抗原抗體反應(yīng)，持續(xù)裂解PSMA陽(yáng)性的靶細(xì)胞。研究人員在間皮瘤腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)[10],含CD137(4-1BB)的二代CAR-T與含CD28的二代CAR-T相比，有同等的抗腫瘤效果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)含有CD137共刺激分子的CAR可減少CAR-T細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)抗凋亡蛋白(例如Bcl-xL)的表達(dá)，以及殺傷腫瘤細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的生成。

為了進(jìn)一步優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的功能，研究人員設(shè)計(jì)出了含有兩個(gè)共刺激分子的CAR-T細(xì)胞。Zhong等[11]在抗前列腺特異性膜抗原模型中發(fā)現(xiàn)含CD28/4-1BB/CD3ζ的三代CAR，能增加細(xì)胞因子的生成，以及體內(nèi)CAR-T細(xì)胞存活率，提高抗腫瘤能力，激活PI3K/AKT通路，上調(diào)Bcl-xL的表達(dá)，減少CAR-T細(xì)胞凋亡。Pule等[12]的實(shí)驗(yàn)含有CD28/OX-40/CD3ζ的第三代CAR-T有更強(qiáng)的體外增殖力，以及在重復(fù)抗原刺激后持續(xù)裂解腫瘤細(xì)胞的能力。 Wilkie等[13]在MUC1-CAR的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)含有CD28/OX-40/CD3ζ的三代CAR-T體外分泌IFN-γ的能力更強(qiáng)。

目前，研究人員正在進(jìn)行四代CAR-T(TRUCKs)的研究[14]。通過(guò)在第三代CAR-T的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染IL-12編碼基因，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞釋放IL-12的能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞及NK-T細(xì)胞向腫瘤組織的趨化及遷移，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力[15]。

3 CAR-T細(xì)胞現(xiàn)階段臨床應(yīng)用

3.1血液系統(tǒng)疾病 近期的研究表明，CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的成功率非常高，特別是B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)。研究表明，應(yīng)用CAR-T細(xì)胞療法治療的患者，甚至是異體造血干細(xì)胞術(shù)后的患者，完全緩解(CR)率可達(dá)70%～94%[16-18]。此外賓夕法尼亞大學(xué)針對(duì)B-CLL的第一個(gè)臨床研究也獲得了較好的結(jié)果，三名使用抗CD19的CAR-T細(xì)胞治療的難治性晚期CLL患者中,兩名患者達(dá)到完全緩解(CR)[19]。四年后，同一研究組的ORR達(dá)57%[20]。在這些積極的結(jié)果影響下，近年來(lái)大量針對(duì)血液系統(tǒng)抗原如CD19、CD20、CD22、CD30的CAR-T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)正如火如荼的展開。相關(guān)結(jié)果提示，CAR-T細(xì)胞療法在霍奇金淋巴瘤(HL)、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)及急性髓性白血病(AML)的治療中同樣很有發(fā)展前景[21-24]。

3.2實(shí)體瘤 迄今為止，CAR-T細(xì)胞在血液系統(tǒng)惡性疾病的治療中取得令人欣喜的成果。在此基礎(chǔ)上，CAR-T細(xì)胞用于治療實(shí)體瘤的研究逐步開展起來(lái)。研究較多的實(shí)體瘤類型有：乳腺癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等。研究較多的靶點(diǎn)有：癌胚抗原(CEA)用于治療結(jié)直腸腺癌、成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)用于治療惡性胸膜間皮瘤，雙神經(jīng)節(jié)苷脂GD2用于治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤，人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)用于治療HER2陽(yáng)性腫瘤，間皮素用于治療胰腺癌，白細(xì)胞介素13受體α(IL-13Rα)用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[25-30]。

然而大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未達(dá)到我們的預(yù)期，實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞療法療效遠(yuǎn)不及血液系統(tǒng)惡性腫瘤。實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤間存在如下差異：首先，血液腫瘤通常較彌散，而實(shí)體瘤在早期即在某一器官或組織內(nèi)形成較為聚集的團(tuán)塊。其次，血液腫瘤的表面靶抗原較為一致，且大多數(shù)惡性細(xì)胞都攜帶有靶抗原；相反，實(shí)體瘤表達(dá)的抗原異質(zhì)性較大，不僅不同實(shí)體瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原不同，同種實(shí)體瘤的不同階段所表達(dá)的抗原也有差異，因此不易找到特異性的靶點(diǎn)。實(shí)體瘤周圍存在免疫抑制微環(huán)境(Immunosup-pressive tumor microenvironment TME)，抑制過(guò)繼轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞向病灶內(nèi)遷移?？傊珻AR-T細(xì)胞療法針對(duì)實(shí)體瘤的治療技術(shù)尚不成熟，仍需進(jìn)一步的研究及試驗(yàn)。

4 CAR-T細(xì)胞療法在肺癌中的應(yīng)用

肺癌是全球男性癌癥相關(guān)死亡的首要原因，是女性癌癥死亡的第二大原因[31]。由于缺乏特異性臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時(shí)已屬于中晚期。盡管在過(guò)去的幾十年中，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療等綜合治療方法的實(shí)施，已在很大程度上改善了患者無(wú)病生存期和總生存期，但5年生存率僅19%。隨著腫瘤生物學(xué)研究的進(jìn)步，以及對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，肺癌的免疫治療近年來(lái)應(yīng)運(yùn)而生。目前主要有兩個(gè)研究方向：一是以CTLA-4抗體和PD-1/PD-L1抗體為代表的阻斷免疫檢查點(diǎn)的封鎖療法，免疫檢查點(diǎn)抗體通過(guò)解除腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的抑制,激活T細(xì)胞功能,恢復(fù)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。二是以CAR-T細(xì)胞療法為主的過(guò)繼細(xì)胞免疫療法。后文將闡述CAR-T細(xì)胞治療肺癌的現(xiàn)狀及問(wèn)題。

5 CAR-T治療肺癌的主要靶點(diǎn)

5.1內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體EGFR 表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)顯著表達(dá)于各種實(shí)體腫瘤的細(xì)胞膜表面，特別是在非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)中。EGFR過(guò)表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤血管生成、以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。 EGFR作為人類腫瘤診斷和治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值已經(jīng)被認(rèn)識(shí)了數(shù)年。Feng等[32]的實(shí)驗(yàn)中觀察到11名晚期復(fù)發(fā)/難治性NSCLC患者在接受抗EGFR CAR-T細(xì)胞治療后均未出現(xiàn)明顯毒副反應(yīng)，2例患者達(dá)到部分緩解(PR)，5例患者疾病穩(wěn)定(SD)期達(dá)2～8個(gè)月。取PR或SD患者的腫瘤組織活檢做免疫組化，結(jié)果證實(shí)以EGFR為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞可以浸潤(rùn)腫瘤組織，誘發(fā)EGFR特異性細(xì)胞毒性。這意味著抗EGFR的CAR-T細(xì)胞可以通過(guò)TME，發(fā)揮免疫殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。

5.2酪氨酸激酶受體EphA2 Eph是受體酪氨酸激酶(RTKs)家族中最大的一類[33]。EphA2在許多發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并與許多癌癥有關(guān)[34]。EphA2在超過(guò)90%的非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)，但在正常肺組織中不表達(dá)。研究表明EphA2的過(guò)表達(dá)與K-RAS基因突變陽(yáng)性患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[35]。Ning等[36]的研究證明抗EphA2 CAR-T細(xì)胞在與EphA2陽(yáng)性靶標(biāo)共培養(yǎng)時(shí)可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ引起腫瘤細(xì)胞裂解，并且在體外實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞毒性效應(yīng)是特異性的。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)以EphA2為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞的顯著抗腫瘤活性。約有15%的肺癌患者在初診時(shí)出現(xiàn)胸腔積液，50%的患者在進(jìn)展后出現(xiàn)胸腔積液[37,38]。該項(xiàng)研究中指出抗EphA2 CAR-T細(xì)胞可以注入胸腔內(nèi)治療EphA2陽(yáng)性的惡性胸腔積液患者，后續(xù)的研究已經(jīng)開始。

5.3黏蛋白1(Mncoprotein，MUC1) MUC1是一種跨膜蛋白,與腫瘤的黏附和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。降低腫瘤細(xì)胞之間直接黏附，使之脫落種植。同時(shí)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[39,40]。MUC1在正常肺組織的表達(dá)極低，但腫瘤發(fā)生時(shí)則顯著過(guò)表達(dá)。Wei等[42]應(yīng)用NSCLC的PDX小鼠模型證實(shí)，以MUC1為靶標(biāo)的CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性殺傷能力。MUC1可以作為小細(xì)胞肺癌免疫治療的可靠靶點(diǎn)。為目前開展的針對(duì)抗MUC1 CAR-T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)(NCT02587689)奠定了基礎(chǔ)。

5.4人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2) HER2是腫瘤相關(guān)抗原，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、惡性腫瘤中顯著表達(dá)。而在正常組織中不表達(dá)或極少表達(dá)[42]。已有研究證實(shí)，抗HER2的CAR-T細(xì)胞在HER2陽(yáng)性的腫瘤患者中有顯著的抗腫瘤療效[43]。為肺癌的治療提供了新思路，目前國(guó)內(nèi)已開展抗HER2 CAR-T細(xì)胞治療肺癌的臨床Ⅰ期研究(NCT02713984)。

5.5間皮素(Mesothelin,MSLN) MSLN是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在多種實(shí)體腫瘤的細(xì)胞表面均質(zhì)表達(dá)，但在肺癌和胃癌中，不僅表達(dá)細(xì)胞表面，也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。多項(xiàng)抗MSLN CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床研究正在開展(NCT01583686、NCT02414269、NCT02580747)。Adusumilli等[44]建立了惡性胸膜間皮瘤原位小鼠模型，在這個(gè)模型中，給予全身或胸腔局部的抗MSLN CAR-T細(xì)胞。胸腔給藥組的CAR-T細(xì)胞增殖能力、存活能力以及腫瘤細(xì)胞殺傷能力高于全身給藥組的30倍?？筂SLN CAR-T細(xì)胞的胸腔局部應(yīng)用促進(jìn)了早期的抗原反應(yīng)，增加細(xì)胞因子分泌，活化免疫相關(guān)T細(xì)胞。此外，該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)胸腔內(nèi)給予的抗MSLN CAR-T細(xì)胞可以在體內(nèi)長(zhǎng)期存在，并在殺滅腫瘤細(xì)胞后的200 d中持續(xù)抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，一項(xiàng)針對(duì)間皮瘤、肺癌和胸膜轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的抗MSLN CAR-T細(xì)胞局部Ⅰ期研究已經(jīng)開展(NCT0241426)。

上述靶點(diǎn)為現(xiàn)有治療肺癌的主要研究方向，除此之外，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3也被證實(shí)是肺鱗狀細(xì)胞癌CAR-T細(xì)胞療法的新型潛在靶點(diǎn)[45]。隨著研究深入會(huì)有更多的靶點(diǎn)應(yīng)用于肺癌的過(guò)繼細(xì)胞療法中，如KRAS、c-MET、BRAF等。

6 CAR-T治療肺癌的問(wèn)題

CAR-T細(xì)胞輸注后最常見最嚴(yán)重的副作用是細(xì)胞因子風(fēng)暴(Cytokine release syndrome，CRS)。由于嵌合抗原受體與相應(yīng)的腫瘤相關(guān)抗原特異性結(jié)合，引發(fā)大量細(xì)胞因子釋放，級(jí)聯(lián)激活多類免疫反應(yīng)[46]。主要臨床表現(xiàn)是高熱、高血壓、呼吸困難甚至多器官衰竭[47]。David等[48]提出了一種預(yù)測(cè)CRS的算法，指出輸注后第一個(gè)月內(nèi)IFN-γ、IL-6、sgp130和sIL-6R的峰值水平可作為sCRS的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。后續(xù)的研究表明，IL-6受體拮抗劑能在不影響CAR-T細(xì)胞功能前提下有效地控制CRS[49]。

其次，脫靶效應(yīng)也是常見的不良反應(yīng)。理想的CAR-T細(xì)胞靶點(diǎn)是在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)的抗原。脫靶效應(yīng)指的是CAR-T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性的過(guò)程中識(shí)別正常機(jī)體的抗原導(dǎo)致機(jī)體正常組織器官的損傷。解決脫靶問(wèn)題，應(yīng)在尋找更安全的靶點(diǎn)同時(shí)，可以通過(guò)降低單鏈抗體的結(jié)合力減輕免疫反應(yīng)[50]，同時(shí)應(yīng)用抑制性CAR，調(diào)控CAR-T細(xì)胞的活性[51]。為提高CAR-T細(xì)胞安全性。研究人員提出了自殺基因療法，即在CAR-T細(xì)胞中引入相關(guān)基因，使表達(dá)這些修飾基因的細(xì)胞會(huì)被分泌的細(xì)胞毒性物質(zhì)殺死，進(jìn)而避免潛在的毒副作用。目前證實(shí)效果較好的基因有可誘導(dǎo)性Caspase-9(iC9)、單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)以及EGFR阻斷基因。其他人工干預(yù)CAR-T細(xì)胞凋亡途徑的研究也正在展開，有望解決相關(guān)問(wèn)題。

肺癌作為實(shí)體瘤的一種，存在腫瘤免疫抑制微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)，TME影響CAR-T細(xì)胞的活化，抑制其殺傷腫瘤的功能。研究人員發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用PD-1/PD L1抗體能有效地解決這一問(wèn)題[52]。另外，研究人員設(shè)計(jì)了同時(shí)針對(duì)VEGF-2及IL-2的CAR-T細(xì)胞[53]，能夠增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤組織的能力。

7 展望

近年來(lái)，隨著對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的逐漸深入，推出了許多新的治療手段。CAR-T細(xì)胞療法作為肺惡性腫瘤治療，近年來(lái)雖然取得了一定進(jìn)展，但仍有許多問(wèn)題亟待解決。通過(guò)尋找更準(zhǔn)確的靶點(diǎn)，進(jìn)一步明了CAR-T細(xì)胞療法的機(jī)制和降低CAR-T細(xì)胞療法所帶來(lái)的副作用，制定出個(gè)體化的治療方案。有理由相信，CAR-T細(xì)胞療法將會(huì)給廣大的肺癌患者帶來(lái)生存上的獲益。