華曉東

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

血小板(PLT)是一種無(wú)細(xì)胞核、呈不規(guī)則形狀的血細(xì)胞，在正常血液中有較恒定的數(shù)量(如人的血小板數(shù)為10～30萬(wàn)/mm3)，在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成等生理和病理過(guò)程中有重要作用。正常的血小板活化聚集是一種必要的防御機(jī)制，但過(guò)度活化會(huì)引起一些血栓性疾病?，F(xiàn)代臨床研究表明[1-3]，許多疾病，尤其是心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展都和血小板活化狀態(tài)變化有關(guān)。因此血小板功能檢查是臨床多種疾病診斷和研究中常用的手段之一。

血小板功能檢查的方法包括血小板黏附性、聚集性及相關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，有時(shí)還輔助以體內(nèi)動(dòng)物血瘀模型實(shí)驗(yàn)對(duì)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行驗(yàn)證。但多數(shù)血小板功能檢查方法煩瑣，難以標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，同時(shí)檢查過(guò)程受人員操作的影響較大[4]。

隨著科技的發(fā)展，血小板生物標(biāo)志物的概念引入血小板功能檢測(cè)領(lǐng)域并逐漸被大家所接受[5]。循環(huán)血液中血小板基本處于靜息狀態(tài),在各種理化和生物因子的作用下,血小板受到刺激而成為活化血小板發(fā)揮聚集作用?；罨瘯r(shí)血小板胞內(nèi)的顆粒膜表面糖蛋白表達(dá)到血小板膜上,在血小板膜表面表達(dá)的這種特定糖蛋白被稱為識(shí)別活化血小板的特異性分子標(biāo)志物，其中最重要的是血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa纖維蛋白原受體(PAC-1)和P選擇素(CD62p)。此外還有CD31、CD63、CD41、CD61、CD62等。

1 主要的血小板活化標(biāo)志物

1.1 血小板活化早期標(biāo)志物 PAC-1是GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物活化后暴露的纖維蛋白原受體,即活化的GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物，僅在血小板活化時(shí)才因構(gòu)象變化而顯露出來(lái)，能精確地反映血小板活化的早期狀態(tài)，是血小板活化早期的重要標(biāo)志物。血小板活化后,PAC-1的活性表達(dá)是引起血小板聚集的最后通路,檢測(cè)血小板表面PAC-1的表達(dá)量可以反映血小板早期活化情況。

1.2 特異性血小板標(biāo)志物 血小板被激活時(shí)，其顆粒膜與質(zhì)膜發(fā)生融合，顆粒膜蛋白(如CD62p、CD63等)在質(zhì)膜上表達(dá)，成為血小板活化后的特異性分子標(biāo)志。其中CD62p為血小板α-顆粒膜糖蛋白,在靜止血小板膜表面僅有極少量表達(dá),當(dāng)血小板活化后,血小板內(nèi)的α顆粒膜糖蛋白通過(guò)開(kāi)放管道系統(tǒng)迅速與胞膜融合,在平均每個(gè)血小板膜上表達(dá)10 000個(gè)左右分子,是識(shí)別活化血小板的最特異性標(biāo)志物。膜糖蛋白(CD62p)和溶酶體蛋白(CD63)均為活化血小板的生物標(biāo)志物，但CD62p特異性更強(qiáng)，被認(rèn)為是血小板活化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

1.3 泛血小板標(biāo)記物 如CD41(GPⅡb)、CD61(GPⅢa)，既可與活化血小板結(jié)合，也可與靜止血小板結(jié)合?？捎糜谠谌?xì)胞中標(biāo)記出血小板，并通過(guò)與其他標(biāo)記物的聯(lián)合使用，在標(biāo)記出的血小板中區(qū)分出活化和未活化的血小板。

2 血小板活化標(biāo)志物的檢測(cè)方法

活化血小板生物標(biāo)志物可采用多種方法進(jìn)行檢測(cè)[6]，如酶聯(lián)吸附試驗(yàn)法(ELISA)、放射免疫試驗(yàn)法(RIA)、免疫比濁法(ITA)等，但大多存在線性較窄、可比性差、干擾因素多等缺點(diǎn)，而流式細(xì)胞術(shù)作為一種高效、快速、多參數(shù)分析的先進(jìn)技術(shù)，可以非常靈敏地檢測(cè)到活化血小板膜表面糖蛋白分子的變化，從而更精確地判斷血小板的活化程度和功能狀態(tài)，進(jìn)而可以準(zhǔn)確地診斷或預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生和進(jìn)展[7]。該方法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)血小板亞群靈敏度高、用血量少、無(wú)放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)隨著技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)的敏感性和特異性也不斷提高,使得對(duì)血小板狀態(tài)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)成為可能，更適用于心腦血管疾病臨床診斷和進(jìn)展預(yù)測(cè)。

3 血小板活化標(biāo)志物的臨床應(yīng)用

3.1 冠心病 冠心病的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(AS),由于AS的發(fā)生，多種因素均可造成血小板的激活。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,血管內(nèi)皮下膠原暴露；冠脈內(nèi)的脂質(zhì)斑塊造成局部血流動(dòng)力學(xué)改變,產(chǎn)生高切變；脂質(zhì)斑塊發(fā)生潰破,脂質(zhì)暴露于血液均可引起血小板活化，因此AS患者是血栓形成的高危患者,各種血小板標(biāo)志物均處于高表達(dá)狀態(tài)。準(zhǔn)確測(cè)定血小板生物標(biāo)志物表達(dá)量對(duì)冠心病的診斷、預(yù)防、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷都有重要意義。吳志福[8]根據(jù)2004年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/心臟病協(xié)會(huì)頒布的《急性冠脈綜合征(ACS)診斷標(biāo)準(zhǔn)》檢測(cè)了104例ACS患者的血小板膜糖蛋白表達(dá)和血小板聚集功能。發(fā)現(xiàn)在ACS狀態(tài)下，CD62p和CD63可被凝血酶活化，使其在血小板表面高表達(dá)，而經(jīng)氯吡格雷維持治療后二者表達(dá)顯著降低，這與血小板聚集率檢測(cè)結(jié)果完全一致，提示CD62p和CD63表達(dá)對(duì)ACS的診斷有明顯提示作用。另一項(xiàng)研究檢測(cè)了66例ACS患者的外周血中CD62p、PAC-1在治療前后的表達(dá)，同期以年齡、性別相匹配的健康人22例為對(duì)照組[9]。結(jié)果顯示ACS患者體內(nèi)血小板處于高度活化狀態(tài)，治療后CD62p、PAC-1表達(dá)率明顯降低，且與血漿黏度、纖維蛋白原濃度呈正相關(guān),顯示CD62p、PAC-1的變化可作為血栓疾病的病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

張文超等[10]選擇38例符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的初治的冠心病患者，采用自身對(duì)照分析法，F(xiàn)CM測(cè)定經(jīng)典藥物阿司匹林治療前后的全血中血小板表面糖蛋白(CD62p/PAC-1)的表達(dá)率。結(jié)果CD62p和PAC-1的表達(dá)能夠被阿司匹林明顯抑制,顯示該指標(biāo)對(duì)抗血栓形成效果的評(píng)價(jià)作用明確，通過(guò)對(duì)CD62p、PAC-1的監(jiān)測(cè)可以對(duì)抗血小板藥物的選擇提供指導(dǎo)。郭壯波等[11]采用FCM測(cè)定23例急性冠脈綜合征(ACS)、52例慢性心肌缺血綜合征(CIS)患者及22名健康對(duì)照者的CD62p和PAC-1表達(dá)率，結(jié)果ACS組PAC-1表達(dá)明顯高于CIS組，而CD62p未見(jiàn)差異。PAC-1是血小板活化的早期指標(biāo),可能更適合用于ACS患者的診斷和治療效果評(píng)價(jià)。同時(shí)已有隨機(jī)、安慰劑對(duì)照的臨床試驗(yàn)證實(shí)[12],GPⅡb/Ⅲa受體拮抗可以有效地抑制血小板聚集,減少亞急性血栓形成，檢測(cè)PAC-1表達(dá)的變化能夠較早地反映血小板的活化情況。

3.2 心肌梗死 心肌梗死是心血管疾病中最常見(jiàn)的疾病之一，心肌梗死的產(chǎn)生、進(jìn)展程度與血小板活化形成血栓密切相關(guān)，可以通過(guò)CD62p含量分析來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。陳運(yùn)平[13]選取確診的心肌梗死患者143例及健康對(duì)照組50例，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD62p的水平變化。結(jié)果心肌梗死患者CD62p含量顯著高于對(duì)照組，表明CD62p高表達(dá)是心肌梗死患者的一個(gè)重要發(fā)病指標(biāo)。

3.3 下肢深靜脈血栓 深靜脈血栓形成(DVT)是指血液在下肢深靜脈腔內(nèi)不正常凝結(jié)，阻塞深靜脈管腔，導(dǎo)致靜脈回流障礙，引起相應(yīng)的血栓性疾病，血小板活化在其中也起著重要的作用。DVT診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是深靜脈造影，但不能用于早期診斷，而且屬有創(chuàng)檢查。葉智賓等[14]選擇下肢深靜脈血栓形成患者80例，用藥前后檢查血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、血小板活化因子，并以下肢深靜脈彩超檢查評(píng)價(jià)臨床療效。結(jié)果DVT患者血漿CD62p、CD63、PAC-1的水平較對(duì)照組明顯升高，溶栓、抗凝治療能顯著降低血漿中上述指標(biāo)水平。表明CD62p、CD63、PAC-1的水平可以作為DVT患者的診斷和治療效果評(píng)價(jià)的可靠指標(biāo)。

3.4 川崎病 川崎病(KD)又稱黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合征(MCLS),目前認(rèn)為是一種由感染原觸發(fā)的免疫介導(dǎo)性全身性血管炎，病死率約為1%～2%,其中60%以上死于心肌梗死。近年來(lái)血小板異?；罨碚撛贙D的病生理研究中越來(lái)越受到重視。龐毅等[15]測(cè)定了20例川崎病患兒發(fā)病1周(治療前)、2周、3周、4周時(shí)血小板膜CD41、CD42a、CD61、CD62p、CD63的表達(dá)，觀察其與冠狀動(dòng)脈損傷形成之間的關(guān)系。結(jié)果川崎病患兒發(fā)病4周內(nèi)血小板膜糖蛋白CD41、CD42a、CD61、CD62p、CD63的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組。其中有冠狀動(dòng)脈損傷的川崎病患兒CD62p的表達(dá)量明顯高于無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷的川崎病患兒。因此可以認(rèn)為血小板高度活化,血液呈高凝狀態(tài)是川崎病病理生理的重要表現(xiàn)，而檢測(cè)CD62p是否出現(xiàn)明顯增高可以作為川崎病患兒冠狀動(dòng)脈損傷的確診指標(biāo)之一。

3.5 急性腦梗死與進(jìn)展性卒中 急性腦梗死(ACI)是常見(jiàn)腦血管疾病，其發(fā)病機(jī)制是由于血管粥樣硬化和血栓形成，血小板處于黏附狀態(tài)，造成腦部小動(dòng)脈缺血、缺氧引起局部腦組織軟化壞死，因此血小板活化是ACI發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。通過(guò)檢測(cè)血小板生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，可以對(duì)血栓的發(fā)展?fàn)顟B(tài)進(jìn)行判斷，幫助醫(yī)生進(jìn)行確診并指導(dǎo)臨床用藥，盡快采取措施延緩腦血栓的發(fā)展，對(duì)降低腦血栓的發(fā)生率，提高患者生存率有重要意義。有研究通過(guò)檢測(cè)ACI患者血漿CD62p表達(dá)率，并與高危組及正常人組進(jìn)行對(duì)照研究，對(duì)CD62p與腦梗死的關(guān)系進(jìn)行分析[16]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD62p陽(yáng)性表達(dá)率5.2%為判定急性腦梗死的限值，判定的敏感度92%，特異度95%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值98%，陰性預(yù)測(cè)值73%，符合率(正確率)92%。CD62p的陽(yáng)性表達(dá)率越高提示病情越重，當(dāng)CD62p高于5.2%時(shí)，發(fā)生腦梗死的可能性極大，為進(jìn)一步尋找腦梗死早期篩查指標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。陳秋月等[17]用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)76例動(dòng)脈粥樣硬化性(CA)腦梗死患者及53例健康體檢者全血血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p陽(yáng)性率,并同時(shí)進(jìn)行頸動(dòng)脈彩色多譜勒超聲檢查。結(jié)果CA腦梗死患者血小板活化程度明顯增高，與彩超顯示的病情進(jìn)展相關(guān)性良好。提示PAC-1、CD62p在CA腦梗死發(fā)病中及梗死后病程發(fā)展監(jiān)測(cè)中均可能起著重要的作用。許海霞等[18]選擇80例腦梗死急性期患者，分別于治療前及治療后7 d和14 d評(píng)定神經(jīng)功能和測(cè)定血小板活化產(chǎn)物CD62p、PAC-1含量進(jìn)行比較。顯示腦梗死急性期經(jīng)溶栓治療后，可降低血小板活化標(biāo)志物表達(dá)，同時(shí)神經(jīng)功能明顯改善，表明CD62p、PAC-1含量測(cè)定對(duì)腦梗死進(jìn)展和預(yù)后監(jiān)控效果明顯。林麗芳等[19]用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性腦梗死組80例和對(duì)照組60例外周血單核細(xì)胞、CD14、CD42a雙陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比，并對(duì)腦梗死患者進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。急性腦梗死早期單核細(xì)胞與血小板聚合物CD14、CD42a表達(dá)明顯增高，且與病情嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。因此檢測(cè)單核細(xì)胞與血小板聚合物CD14、CD42a水平對(duì)于腦梗死患者早期診斷及預(yù)測(cè)病情輕重具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。一項(xiàng)回顧性研究[20]分析了收治的72例急性腦梗死患者，選取同時(shí)期健康體檢的75例為對(duì)照組，觀察其血小板聚集性和血小板活化指標(biāo)含量變化情況。結(jié)果急性腦梗死患者血小板活化水平明顯升高，聚集功能明顯增強(qiáng)，各指標(biāo)含量與病人臨床表現(xiàn)明顯相關(guān)。另一項(xiàng)研究通過(guò)全血流式細(xì)胞術(shù)檢查50例腦血栓患者血小板活化標(biāo)志物α顆粒膜糖蛋白(CD62p)、溶酶體膜糖蛋白(CD63)的陽(yáng)性率，并與健康者進(jìn)行對(duì)比[21]，也充分驗(yàn)證了上述結(jié)果。

進(jìn)展性卒中(PS)是指發(fā)病后患者神經(jīng)功能缺損癥狀在48 h內(nèi)進(jìn)展或呈階梯式加重，腦血管病中有1/4以上的腦梗死為PS,其病死率高。在PS的治療中，早期發(fā)現(xiàn)是治療的關(guān)鍵。在兩項(xiàng)分別檢測(cè)37例PS患者、40例穩(wěn)定型腦梗死患者和45名健康對(duì)照者[22]以及152例急性腦梗死患者和30例健康對(duì)照者[23]外周血血小板膜糖蛋白的研究中，顯示不同原因的腦梗死均與血小板膜糖蛋白密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)腦梗死患者CD62p和PAC-1表達(dá)與臨床神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分均存在顯著正相關(guān)性，提示CD62p和PAC-1表達(dá)量越高，腦卒中病情越重。表明腦梗死患者體內(nèi)血小板活化程度明顯增高，血小板活化是腦卒中早期治療或二級(jí)預(yù)防的重要靶點(diǎn)，而CD62p、PAC-1表達(dá)可以作為反映腦梗死病情變化、預(yù)測(cè)預(yù)后的敏感指標(biāo)。

3.6 膿毒血癥 膿毒血癥是由于感染引起的全身性嚴(yán)重反應(yīng)綜合征，其發(fā)病機(jī)制目前還沒(méi)有準(zhǔn)確的定論，但凝血系統(tǒng)的活化會(huì)明顯加重膿毒血癥患者病情的發(fā)展，而血小板在炎癥和凝血間占據(jù)著最主要的作用。黃君華等[24]檢測(cè)了23例器官功能正常、17例器官功能不全的膿毒血癥患者的外周血中血小板膜糖蛋白含量，并以正常人為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)膿毒血癥患者CD62p、CD63均高于正常人，外周血中血小板明顯處于高度活化狀態(tài)，其活化程度與患者病情呈正相關(guān)。提示CD62p、CD63可以作為患者臟器損傷程度的有效指標(biāo)之一。另兩項(xiàng)將膿毒癥患者按急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分分組的研究[25，26]也顯示隨著APACHEⅡ評(píng)分升高，患者CD62p、CD63表達(dá)均上調(diào)。在膿毒癥患者發(fā)病24 h內(nèi)CD62p明顯增加,CD62p水平與APACHEⅡ評(píng)分呈顯著正相關(guān),而隨著膿毒癥患者病情的加重，CD63陽(yáng)性表達(dá)率與正常對(duì)照組比較也顯著升高，與APACHEⅡ評(píng)分也呈顯著正相關(guān),故說(shuō)明監(jiān)測(cè)膿毒癥患者血小板CD62p和CD63水平在一定程度上反映膿毒癥患者的病情發(fā)生和進(jìn)展程度,并對(duì)判斷預(yù)后有一定的價(jià)值。同時(shí)提示在膿毒癥早期,通過(guò)拮抗血小板的異?；罨涂鼓委?可以改善患者癥狀,為膿毒癥治療提供了一種新手段。

3.7 腫瘤 臨床研究表明[27]，惡性腫瘤患者普遍存在高凝狀態(tài)。高凝狀態(tài)也稱為血栓前狀態(tài)，是由多種因素共同引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及凝血、纖溶、抗凝系統(tǒng)等功能失調(diào)，進(jìn)而引起肌體血液凝固性增高，易于形成血栓。在晚期肺癌患者中，靜脈血栓栓塞癥的發(fā)生率達(dá)13.6%，高凝狀態(tài)給腫瘤患者臨床治療帶來(lái)了困難，增加了病死率，因此，臨床上監(jiān)控和改善惡性腫瘤高凝狀態(tài)在腫瘤的綜合治療過(guò)程中不容忽視。王為光等[28]選擇急性白血病初次確診未治患者28例，急性白血病誘導(dǎo)后早期完全緩解患者16例，長(zhǎng)期完全緩解患者(緩解期達(dá)2年以上)10例，正常對(duì)照組30例。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其全血中PAC-1、CD62p、CD63水平，觀察其在二磷酸腺苷(ADP)激活前后表達(dá)的差異。急性白血病初診未治時(shí)外周血血小板活化增多，ADP激活后活化功能降低，黏附、聚集功能減低，誘導(dǎo)后早期完全緩解階段血小板聚集、黏附、活化功能較初診未治時(shí)有所恢復(fù)，但仍處于異常狀態(tài)，長(zhǎng)期完全緩解階段血小板膜糖蛋白表達(dá)正常，其血小板功能亦恢復(fù)正常。血小板的黏附、聚集和活化功能可通過(guò)其表面膜糖蛋白的表達(dá)來(lái)充分反映。因此對(duì)預(yù)防急性白血病患者出血的研究與防治具有重要價(jià)值。

3.8 先兆性子癇 易正山等[29]檢測(cè)了25例正常人與20例正常孕婦及22例先兆子癇孕婦靜息態(tài)及ADP活化后CD41a、CD62p、CD63等血小板膜糖蛋白的表達(dá)量，結(jié)果先兆子癇孕婦組CD62p、CD63表達(dá)量均較正常孕婦組顯著增高，而CD41a表達(dá)無(wú)顯著性差異。因此通過(guò)監(jiān)控產(chǎn)婦體內(nèi)血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的表達(dá)水平,可以達(dá)到早期診斷先兆子癇的效果。

3.9 急性一氧化碳中毒 急性一氧化碳中毒(ACOP)是一個(gè)世界性問(wèn)題,在我國(guó)ACOP的發(fā)病率及死亡率均居高不下。ACOP患者尸檢后腦部小血管可見(jiàn)到充血、血栓、出血等病理改變，提示腦部小血栓形成在CO中毒腦病的發(fā)展過(guò)程中有著重要作用。侯曉敏等[30]研究了急性一氧化碳中毒(ACOP)患者血小板膜糖蛋白的變化。結(jié)果ACOP組CD63、PAC-1和CD62p的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組。且CD63和PAC-1在一段時(shí)間內(nèi)將維持較高水平。通過(guò)監(jiān)控這些血小板生物標(biāo)志物水平，可以指導(dǎo)ACOP后抗血小板活化治療時(shí)間并為ACOP提供預(yù)測(cè)預(yù)后的敏感指標(biāo)。

總之，血小板活化與多種疾病相關(guān)，其活化程度可由血小板膜糖蛋白表達(dá)水平的高低來(lái)判斷，而應(yīng)用FCM測(cè)定血小板膜糖蛋白的表達(dá)情況已成為檢查血小板功能的一種新手段，對(duì)血小板活化相關(guān)疾病的診斷、治療、監(jiān)測(cè)有著極其重要的作用。