李宇健，陳復(fù)生，郝莉花，夏義苗，趙自通(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

水酶法的原理是采用能降解油料植物細(xì)胞壁，或?qū)χ鞍?、脂多糖等大分子?fù)合物具有水解作用的酶來(lái)處理油料，破壞其組織結(jié)構(gòu)、水解大分子復(fù)合體，并利用非油成分對(duì)水和油親和力不同以及水油的密度差將油脂和蛋白質(zhì)分離出來(lái)[1]?；ㄉ械闹饕煞譃橛椭偷鞍踪|(zhì)，其子葉的含油細(xì)胞中儲(chǔ)存著花生的脂肪和蛋白質(zhì)?；ㄉ杏椭拇嬖谛问綖橹睆?.1 μm的油脂體，蛋白質(zhì)的存在形式為直徑2～10 μm 的蛋白體亞細(xì)胞[2]。因此，在水酶法工藝中，油料的粉碎程度對(duì)提高油料有效成分的得率起著重要作用。采用機(jī)械粉碎，最大程度破壞油料細(xì)胞，作為水酶法預(yù)處理工藝十分關(guān)鍵[3]。機(jī)械粉碎可降低油料的粒度、破壞油料的細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)有效成分易于釋放，有利于物料與酶接觸面積的增加，提高酶的作用效果[4]。

朱凱艷等[5]研究花生粉碎程度對(duì)花生水酶法提取油脂和水解蛋白得率以及提油過(guò)程所得乳狀液穩(wěn)定性的影響，用蛋白酶提取花生水解蛋白和油脂，得率分別為77.5%和88.8%。但目前使用纖維素酶對(duì)粉碎處理后花生營(yíng)養(yǎng)成分及組成影響規(guī)律的研究鮮有人探討。本試驗(yàn)使用纖維素酶研究花生粉碎程度對(duì)水酶法提取油脂和蛋白質(zhì)的影響，利用高效液相色譜和氣相色譜分析比較花生中氨基酸、α-維生素E和花生油中脂肪酸含量的變化規(guī)律，分析粉碎程度對(duì)花生營(yíng)養(yǎng)成分的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

花生購(gòu)于鄭州市丹尼斯超市，去殼后貯存于4℃冰箱待用。37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，上海安譜公司；異辛烷、氫氧化鈉、甲醇，色譜純；纖維素酶，丹麥諾維信(中國(guó))有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BT-9300H激光粒度分布儀；Waters2695高效液相色譜儀，配Waters 氨基酸分析包，美國(guó)沃特斯公司；Agilent 6890N氣相色譜儀，配FID檢測(cè)器，SP-2560毛細(xì)管柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；純凈儀，美國(guó)默克密理博公司；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；BSA224S-CW型分析天平；THZ-82型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器；K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀；FM200均質(zhì)機(jī)；TDL-5-A型低速離心機(jī)；LGJ-25型冷凍干燥機(jī)；DZF-2B型真空干燥箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要成分測(cè)定

水分含量測(cè)定：參照GB/T 5009.3—2003測(cè)定；粗脂肪含量測(cè)定：參照GB/T 5009.6—2003測(cè)定；粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照GB/T 5009.5—2003測(cè)定；灰分含量測(cè)定：參照GB/T 5009.4—2003測(cè)定。

1.2.2 不同方式粉碎去皮花生

將去皮花生以?xún)煞N方式粉碎，第一種是將去皮花生粉碎1～7次，每次的粉碎時(shí)間為2 s(±0.5 s)；第二種是將去皮花生粉碎不同時(shí)間，2 s遞增，粉碎時(shí)間分別為2～14 s(±0.5 s)。

1.2.3 花生粉碎后粒徑的測(cè)定

取0.5 g粉碎后的花生，放置于50 mL去離子水中。常溫振蕩20 min使粉碎的花生均勻分散在液體中。將料液滴入激光粒度分布儀的樣品池中進(jìn)行測(cè)定，得出體積平均粒徑。

1.2.4 花生粉碎后脂肪酸含量變化測(cè)定

參照GB 5009.168—2016，將粉碎的花生用索氏提取裝置提取油脂，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮干殘留的有機(jī)溶劑，過(guò)程中充氮?dú)獗Ｗo(hù)。將提取的油脂用2%氫氧化鈉甲醇溶液于80℃±1℃水浴上回流甲酯化，直至油滴消失，再加入15%三氟化硼甲醇溶液繼續(xù)回流2 min，此過(guò)程中充氮?dú)獗Ｗo(hù)。甲酯化結(jié)束后，加入正庚烷和飽和氯化鈉水溶液，靜置分層，取上層正庚烷層，并用無(wú)水硫酸鈉脫除水分。取正庚烷提取液上Agilent 6890N氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸組成。

1.2.5 花生粉碎后氨基酸含量變化測(cè)定

按照GB 5009.124—2016的方法測(cè)定。稱(chēng)取粉碎后的花生2～5 g于水解管中，加入鹽酸4 mL(12 mol/L)，在110℃水解22 h，用高效液相色譜儀分析氨基酸組成。

1.2.6 花生粉碎后α-維生素E含量變化測(cè)定

按照GB/T 5009.82—2003的方法測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取1～10 g粉碎花生，置于皂化瓶，加30 mL無(wú)水乙醇攪拌使其分散均勻。加5 mL 10%抗壞血酸，苯并芘標(biāo)準(zhǔn)液2.00 mL，混勻。加入10 mL氫氧化鉀，混勻。于沸水浴回流30 min使其完全皂化。皂化后立即放入冰水中冷卻。將皂化后的試樣移入分液漏斗中，用50 mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用約100 mL乙醚分2次洗滌皂化瓶及殘?jiān)?，乙醚液并入分液漏斗中。用約50 mL水洗分液漏斗中的乙醚層，用pH試紙檢驗(yàn)直至水層不顯堿性。后經(jīng)濃縮取上清液供液相色譜分析。

色譜條件：SinoChrom Si60色譜柱(5 μm，4.6 mm×25 cm)；流動(dòng)相為98%甲醇和2%水；流速為1.7 mL/min；RF-510LC檢測(cè)器波長(zhǎng)300 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.7 水酶法提取花生油和蛋白質(zhì)

稱(chēng)取20 g不同粉碎方式的去皮花生，加入100 mL 的去離子水，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)使花生原料均勻分散在液體中，按20 U/g向原料中加入纖維素酶，50℃振蕩酶解2 h，后將料液離心(20 min，4 000 r/min)，分離得到油、乳狀液、蛋白水解液和渣。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理組采用One-Way方差分析(ANOVA)和Duncan’s multiple range tests(P<0.05)分析方法進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。

2 結(jié)果與討論

2.1 花生的主要成分

去皮花生的主要成分分析結(jié)果如表1所示。由表1可知，在去皮花生中，粗脂肪和粗蛋白質(zhì)的含量占花生總質(zhì)量的75%以上。

表1 去皮花生的主要成分 %

2.2 粉碎次數(shù)與粉碎時(shí)間對(duì)粒徑的影響

花生體積平均粒徑與粉碎次數(shù)和粉碎時(shí)間的關(guān)系如圖1所示。

圖1 花生體積平均粒徑與粉碎次數(shù)和粉碎時(shí)間的關(guān)系

由圖1(A)可知，粉碎花生的體積平均粒徑隨著粉碎次數(shù)的增加逐步降低，前4次的粉碎花生體積平均粒徑迅速降低，從60 μm降低至27 μm。之后粉碎花生體積平均粒徑下降速度減緩，第7次粉碎后，粉碎花生花體積平均粒徑降低到19 μm。由圖1(B)可知，隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，8 s以前粉碎花生的體積平均粒徑持續(xù)下降，與圖1(A)有相似的趨勢(shì)，8～12 s粉碎花生的體積平均粒徑降低趨勢(shì)減緩。物料粉碎通常用物理方法來(lái)克服物料內(nèi)部的結(jié)合力，使其破碎達(dá)到一定粒度。根據(jù)原料和成品顆粒粒度，粉碎可分為粗粉碎、細(xì)粉碎、微粉碎和超微粉碎4種類(lèi)型(見(jiàn)表2)。由表2可知，本試驗(yàn)的粉碎類(lèi)型屬于微粉碎。

表2 粉碎類(lèi)型[6]

對(duì)比兩種粉碎方法，在粉碎條件、累積時(shí)間相同的情況下，兩種粉碎花生的體積平均粒徑分布無(wú)明顯差別。花生中的油脂和蛋白質(zhì)主要集中于長(zhǎng)70 μm、寬40 μm的花生子葉含油細(xì)胞中，粉碎時(shí)間短會(huì)造成粉碎的花生顆粒不均勻，有大量未被破碎的顆粒。在使用纖維素酶進(jìn)行水酶法提取花生中油脂和蛋白質(zhì)的過(guò)程中，粉碎花生的粒徑過(guò)大或過(guò)小都會(huì)產(chǎn)生影響，粉碎顆粒過(guò)大，纖維素酶能接觸的作用位點(diǎn)少；反之，粉碎顆粒過(guò)小，纖維素酶對(duì)花生細(xì)胞壁的作用對(duì)提取率的影響就會(huì)減小而變得不明顯，而且會(huì)使乳化現(xiàn)象加重，不利于提高提取率。

2.3 粉碎時(shí)間對(duì)殘油率和蛋白質(zhì)得率的影響

粉碎時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率和殘油率的影響如圖2所示。

注：圖中標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

圖2不同粉碎時(shí)間對(duì)殘油率和蛋白質(zhì)得率的影響

由圖2(A)可知，隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，花生渣中的殘油率持續(xù)降低。在粉碎初期，花生渣中的殘油率很高，這是因?yàn)榉鬯榈幕ㄉw粒粒徑過(guò)大，導(dǎo)致渣中還有大顆粒的花生原料，其中的油脂沒(méi)有通過(guò)水酶法的作用被釋放出來(lái)。在粉碎時(shí)間為10 s時(shí)，粉碎花生的體積平均粒徑減小到32 μm左右，此時(shí)花生渣的殘油率較低，為14.8%。

水酶法提油的同時(shí)能得到高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。由圖2(B)可知，隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)得率出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)，在粉碎時(shí)間為10 s時(shí)，蛋白質(zhì)得率達(dá)到最高，為70.5%，蛋白質(zhì)得率增加最大幅度在粉碎時(shí)間為4～6 s時(shí)，即粉碎花生體積平均粒徑從48 μm降低到40 μm。粉碎時(shí)間超過(guò)10 s后，蛋白質(zhì)得率有些許下降，這證明了粉碎花生的體積平均粒徑進(jìn)一步減小時(shí)，花生含油細(xì)胞中的油脂體被破碎，油脂釋放出來(lái)與蛋白質(zhì)在水相發(fā)生乳化現(xiàn)象，所以蛋白質(zhì)得率下降，同時(shí)增加了乳狀液破乳的難度，這也會(huì)影響油脂的得率。

2.4 粉碎時(shí)間對(duì)脂肪酸的影響

油脂中的脂肪酸決定了油脂主要的營(yíng)養(yǎng)功能，花生油中不飽和脂肪酸含量很高，其中主要是油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)，還有少量的花生烯酸(C20∶1)、棕櫚油酸(C16∶1)、亞麻酸(C18∶3)。飽和脂肪酸主要為棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生酸(C20∶0)、山崳酸(C22∶0)、木焦油酸(C24∶0)。以花生油中主要的3種不飽和脂肪酸(C18∶1、C18∶2、C20∶1)總和與主要的4種飽和脂肪酸(C16∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶0)總和的變化反映粉碎時(shí)間對(duì)花生油中脂肪酸含量變化的影響。粉碎時(shí)間對(duì)花生油中脂肪酸含量的影響規(guī)律如表3所示。

表3 不同粉碎時(shí)間對(duì)花生油中主要脂肪酸含量的影響

由表3可知，隨著粉碎時(shí)間由2 s延長(zhǎng)到12 s，花生油生飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸都有微弱的下降趨勢(shì)，飽和脂肪酸含量下降了8.4%，不飽和脂肪酸含量下降了4.4%。花生油中含有的反式脂肪酸是反式油酸、反式亞油酸，其含量隨著粉碎時(shí)間由 2 s 延長(zhǎng)至12 s，增加了140%。這可能是因?yàn)榉鬯楹蟮幕ㄉ图?xì)胞破裂而釋放油脂，油脂與氧氣接觸，脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致脂肪酸含量下降。因此，在花生粉碎時(shí)，粉碎時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。反式脂肪酸含量升高可能是因?yàn)榉鬯檫^(guò)程中粉碎機(jī)高速旋轉(zhuǎn)，使得粉碎花生溫度升高。在高溫條件下發(fā)生不飽和脂肪酸異構(gòu)化，主要是由于活化能的熱能作用下使順式結(jié)構(gòu)發(fā)生異構(gòu)化[7]。許多研究表明大量食用含反式脂肪酸的食物會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化，容易導(dǎo)致心腦血管疾病、冠心病、糖尿病和老年癡呆等疾病[8]。

2.5 粉碎時(shí)間對(duì)氨基酸的影響

Monteiro等[9]研究表明，花生各組分蛋白質(zhì)均含有18種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸。其中總蛋白中半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴(lài)氨酸含量低，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸含量較高。粉碎時(shí)間對(duì)花生中氨基酸含量的影響規(guī)律如表4所示。

表4 不同粉碎時(shí)間對(duì)花生中主要氨基酸含量的影響

注：同行標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表4可知，隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，6種主要氨基酸的含量都有不同程度下降，其中絲氨酸下降最多，粉碎時(shí)間14 s與粉碎時(shí)間4 s時(shí)比，絲氨酸含量從14.65 mg/g下降到9.95 mg/g，降低了32.1%。在粉碎時(shí)間從4 s延長(zhǎng)到6 s時(shí)，除了亮氨酸外其他幾種主要氨基酸的含量都有顯著的下降。天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸在粉碎時(shí)間從6 s延長(zhǎng)到8 s時(shí)，含量也都有顯著的下降，各主要氨基酸含量在 8 s 后下降的趨勢(shì)變緩?；ㄉ邪被峥偭侩S粉碎時(shí)間的變化如圖3所示。

由圖3可知，氨基酸總量隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)逐步下降，由307.5 mg/g降低到269.9 mg/g，下降了12.2%。粉碎時(shí)間由4 s延長(zhǎng)到6 s時(shí)氨基酸總量下降趨勢(shì)顯著。這可能是隨著粉碎花生粒徑逐步降低，花生蛋白中的氨基酸受到物理作用力的影響，氨基酸結(jié)構(gòu)被破壞進(jìn)而其含量降低。有研究表明隨著溫度的升高，天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、絲氨酸含量會(huì)降低[10]。

圖3 花生中氨基酸總量隨粉碎時(shí)間的變化

2.6 粉碎時(shí)間對(duì)α-維生素E含量的影響

維生素E是人體必須從外界獲取的必要維生素之一，對(duì)于植物本身具有提高其抗氧化性、延長(zhǎng)種子壽命的作用[11]，但是粉碎過(guò)程是否會(huì)對(duì)其含量產(chǎn)生影響，目前研究報(bào)道較少。粉碎時(shí)間對(duì)花生中α-維 生素E含量的影響如表5所示。

表5 不同粉碎時(shí)間對(duì)花生中α-維生素E含量的影響

由表5可知，花生中α-維生素E含量隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，但升高的幅度很小。這可能是粉碎處理使得α-維生素E更容易被釋放出來(lái)。鞠陽(yáng)[12]研究發(fā)現(xiàn)，微波處理后油料中的維生素E含量有一定程度的升高。甘曉露等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著烘烤溫度的升高(130～220℃)，水酶法提取的花生油中的α-維生素E含量先呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而后隨著溫度升高逐漸上升。

3 結(jié) 論

使用小型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎去皮花生，相同粉碎時(shí)間情況下單次和多次粉碎的花生體積平均粒徑?jīng)]有顯著區(qū)別。粉碎花生體積平均粒徑隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，粉碎時(shí)間為10 s時(shí)，粉碎花生體積平均粒徑下降到32 μm左右，此時(shí)蛋白質(zhì)得率達(dá)到最高，為70.5%，殘油率較低，為 14.8%。繼續(xù)延長(zhǎng)粉碎時(shí)間，粉碎花生體積平均粒徑過(guò)小會(huì)導(dǎo)致乳化現(xiàn)象加重，蛋白質(zhì)得率出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

隨著粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，花生油中脂肪酸和花生中氨基酸發(fā)生氧化，粉碎時(shí)間由2 s延長(zhǎng)到12 s時(shí)花生油中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量分別下降了8.4%和4.4%，反式脂肪酸含量增加了140%；α-維 生素E含量略微升高。綜合考慮，當(dāng)粉碎時(shí)間為10 s，粉碎花生體積平均粒徑達(dá)到32 μm左右時(shí)，花生中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失相對(duì)較小，適合作為最優(yōu)的粉碎條件用于水酶法提取花生油和蛋白質(zhì)的研究。

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