袁 露，仇麗霞，唐曉磊(.山西醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,太原 03000； .青海省疾控中心，西寧 8000)

微孔草(MicroulasikikimensisHemsl.)系紫草科微孔草屬，分布于青藏高原海撥2 000～5 000 m的高寒草甸，是野生珍稀油料植物[1-6]，是獲取純天然，高營(yíng)養(yǎng)不飽和脂肪酸的又一新途徑[7-8]。不飽和脂肪酸一直是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，尤其在調(diào)脂、降血壓、降血糖、護(hù)眼功能等方面有深入的研究[9-11]。不飽和脂肪酸有其強(qiáng)大的生物學(xué)活性，而其合成絕大多數(shù)依賴于天然油料作物的供給[12-13]。微孔草的綜合利用可以加快西部地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

盡管微孔草籽油的安全性已得到證實(shí)[14-15]，但由于微孔草籽油軟膠囊中添加了其他中草藥成分，配伍的安全性有待于研究，且在申報(bào)保健食品等高附加值產(chǎn)品前均必須開展此類研究。本文對(duì)微孔草籽油軟膠囊進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和遺傳毒性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)微孔草籽油軟膠囊的毒理學(xué)安全性問(wèn)題，以期為人體的合理攝入提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠(SPF級(jí))、飼料、墊料、屏障環(huán)境均由青海省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(青)2005-0001，試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(青)2005-0001。

1.1.2 原料與試劑

微孔草籽油軟膠囊，主要成分為微孔草籽油、石斛和葡萄籽提取物等，0.5 g/粒，白色膠囊，密度0.9 g/mL，由西北高原生物研究所提供，批號(hào)20110100。

2-氨基芴，上海研拓生物科技有限公司，批號(hào)：20150511；4-硝基喹啉-氮氧化物，上海瑞齊生物科技有限公司，批號(hào)：10140701；柔毛霉素，鄭州森?；?，批號(hào)：20830813；疊氮化鈉，湖北興銀河化工有限公司，批號(hào)：20111206；絲裂霉素，海正輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：33020786；順鉑，上海瑞齊生物科技有限公司，批號(hào)：21110841；環(huán)磷酰胺(CP)，上海瀚思化工有限公司，批號(hào)：60551920。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ME-104E電子天平，上海加內(nèi)特機(jī)電設(shè)備有限公司；徠卡DM1000生物顯微鏡，中輝徠博(北京)儀器有限公司；WJ-2-80培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)儀器有限公司；SHA-2A恒溫水浴振蕩搖床，常州訊聲儀器有限公司；YXQ-LS-100G壓力蒸汽消毒鍋，上海博訊儀器有限公司；GRX-9023A干熱烤箱，上海橫琴儀器設(shè)備有限公司；DW-86L338低溫冰箱，青島海爾有限公司；XK97-A菌落計(jì)數(shù)器，濟(jì)南杰島分析儀器有限公司；TGL16B低溫高速離心機(jī)，常州鼎豐儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和遺傳毒性試驗(yàn)

參照GB 15193.1—2003《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和Ames試驗(yàn)。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

小鼠(SPF級(jí))40只，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中單次經(jīng)口給予18 g/kg，喂養(yǎng)14 d，動(dòng)物無(wú)死亡、無(wú)明顯中毒反應(yīng)。小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)前后體重見表1。小鼠體重變化采用重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果顯示試驗(yàn)組和對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.051，P>0.001)；不同性別間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.321，P>0.001)；試驗(yàn)前后小鼠體重有差別(F=524.231，P<0.001)，由表1可知，試驗(yàn)后體重增加。按食品急性經(jīng)口毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)衡量屬無(wú)毒級(jí)。

表1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)前后體重

2.2 精子畸形試驗(yàn)

昆明種雄性健康小鼠(SPF級(jí))50只，隨機(jī)分成5組，微孔草籽油軟膠囊對(duì)小鼠精子的影響見表2。

表2 微孔草籽油軟膠囊對(duì)小鼠精子的影響

注：0.04(CP)為陽(yáng)性對(duì)照，下同；字母完全不同表示組間LSD-t多重比較在α=0.05的水平上差異顯著。

由表2可知，無(wú)定形畸形所占比重較大?？偟膩?lái)說(shuō)，精子畸形率經(jīng)平方根反正弦變換后采用方差分析得5組間有差異(F=1 487.416，P<0.001)；采用LSD多重比較得5 g/kg組精子畸形率略高于溶劑對(duì)照組與低劑量組，10 g/kg組精子畸形率略高于溶劑對(duì)照組，不同劑量組間精子畸形率水平較接近，在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的正常范圍內(nèi)，仍能表明該受試品精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性；不同劑量組間精子畸形率均低于陽(yáng)性對(duì)照組(t=5.631,P<0.05)。說(shuō)明該受試物無(wú)致突變作用。

2.3 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

微孔草籽油軟膠囊對(duì)小鼠骨髓微核細(xì)胞的影響見表3。對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，嗜多染紅細(xì)胞與紅細(xì)胞比值(PCE/RBC)的比較采用方差分析，性別間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雄性的比值高于雌性(F=7.354，P<0.001)，因結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值正常范圍內(nèi)，該差異并無(wú)實(shí)際意義；不同組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.043，P<0.001)，進(jìn)一步采用LSD多重比較，不同劑量組間均與陽(yáng)性對(duì)照組有差異(t=4.445,P<0.001)，與溶劑對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.223，P>0.001)，受試物不同劑量組間未成熟RBC占RBC總數(shù)的比例均不小于溶劑對(duì)照組的20%，說(shuō)明該受試物無(wú)致突變作用。微核率采用平方根反正弦變換后進(jìn)行方差分析，性別間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.525，P>0.001)；不同組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=102.928，P<0.001)。進(jìn)一步采用LSD多重比較，不同劑量組間微核率均與陽(yáng)性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=7.839，P<0.001)，與溶劑對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.332,P>0.001)，且均在本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值正常范圍內(nèi)，表明受試品本次試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表3 微孔草籽油軟膠囊對(duì)小鼠骨髓微核細(xì)胞影響

2.4 Ames試驗(yàn)

本次試驗(yàn)共設(shè)定自發(fā)回變組、樣品組(分為5個(gè)劑量)、溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組設(shè)定6皿平行皿。微孔草籽油軟膠囊對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗(yàn)菌株在加與不加S9時(shí)，8個(gè)組間菌落數(shù)見表4。對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由于大部分組間菌落數(shù)方差不齊，故采用多組比較的秩和檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各菌株無(wú)論加不加S9不同組間菌落數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(H=20.055,P<0.001)，采用擴(kuò)展t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，5個(gè)劑量組、溶劑對(duì)照組、自發(fā)回變組菌落數(shù)均低于陽(yáng)性對(duì)照組(t=9.255,P<0.001)；5個(gè)劑量組與自發(fā)回變組、溶劑對(duì)照組菌落數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.333,P>0.001)，均未超過(guò)溶劑對(duì)照組和自發(fā)回變組菌落數(shù)的2倍，也無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系，按照評(píng)價(jià)程序判定，本次試驗(yàn)結(jié)果為陰性，未見其誘變作用。

表4 不同菌株微孔草籽油軟膠囊Ames試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

微孔草籽油軟膠囊對(duì)SPF級(jí)昆明種小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，單次灌胃劑量達(dá)18 g/kg,在14 d觀察期內(nèi)動(dòng)物無(wú)死亡、未見明顯中毒癥狀，依據(jù)急性毒性分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，該受試品屬無(wú)毒級(jí)；3項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)(精子畸形試驗(yàn)，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和Ames試驗(yàn))結(jié)果均為陰性。

[1] 陳志, 索有瑞. 微孔草種籽油對(duì)小白鼠血脂水平的影響[J]. 青海醫(yī)藥雜志, 1997(4):12-13.

[2] 李茂言, 何利城, 吳志成.微孔草總油對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥的防治作用[J]. 中國(guó)中藥雜志,1999, 24(2):106-108.

[3] 吳素萍.特種油料——微孔草的開發(fā)利用現(xiàn)狀[J]. 糧油加工, 2009(3):44-46.

[4] 韓發(fā), 程大志, 師生波, 等. 我國(guó)優(yōu)質(zhì)野生植物微孔草資源的研究與開發(fā)利用進(jìn)展[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2007，26(5):5-9.

[5] 劉玉萍，吳學(xué)明，蘇旭, 等. 青海省微孔草資源及開發(fā)利用前景[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006，15(3):37-40.

[6] 馬壽福, 刁治民, 鄧君, 等. 青海微孔草經(jīng)濟(jì)價(jià)值及開發(fā)利用前景 [J]. 青海草業(yè), 2007, 16(3):37-40.

[7] 曹越, 趙先恩, 索有瑞. 微孔草籽油脂肪酸的HPLC-MS分析[J]. 中國(guó)油脂,2010，35(4):72-76.

[8] 吳淑娟, 張一弓, 張麗靜, 等. 微孔草Actin基因核心片斷的克隆及序列分析[J]. 草業(yè)科學(xué), 2010, 27(4):97-101.

[9] TZHANG B S,YANG S F, FU S G, et al. Effect of dietary flaxseed on cholesterol metabolism of hamsters[J]. Food Chem,2009,114(4):1450-1455.

[10] NGUYEN C T, BUI B V, SINCLAIR A J, et al. Dietaryomega-3 fatty acid decrease intraocular pressure with age by increasing aqueous outflow[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48:756-762.

[11] PINHERO M N Jr, DOS SANTOS P M, DOS SANTOS R C, et al. Oral flaxseed oil(Linumusitatissimum) in the treatment for dry-eye Sjogren’s syndrome patients[J]. Arq Bras Talmol, 2007,70:649-655.

[12] 鄭秋甫.Omega-3多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J]. 中華保健醫(yī)學(xué), 2011，13(5):357-360.

[13] 高宗穎, 蘇麗, 袁麗, 等. 多不飽和脂肪酸的應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)， 2011(2):39-41.

[14] 陳建國(guó), 來(lái)偉旗, 梅松, 等. 微孔草籽油的安全性評(píng)價(jià)[J]. 毒理學(xué)雜志, 2008，22(1):79-80.

[15] 郭紅云, 梁濤，張永東，等. 微孔草籽油對(duì)大鼠胚胎毒性和致畸作用研究[J]. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2009，15(12)： 1135-1137.