奧文芳,王承明,李克超,張乃片,張 瑤,王小燕(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，武漢430070)

花生蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，幾乎包括人體必需的8種氨基酸，不含營養(yǎng)抑制物質(zhì)，是繼大豆蛋白之后最具有廣闊發(fā)展前景的蛋白質(zhì)[1]。但是，我國每年900多萬t的熱榨花生粕大部分被用作飼料或肥料，而這些花生粕的蛋白質(zhì)含量達(dá)到40%～50%[2]，利用其提取花生蛋白，可為食品工業(yè)提供高蛋白食品原料，有利于提高花生粕的附加值。

花生蛋白由于含有90%鹽溶性蛋白，在弱酸性條件下溶解度很低，要想將其與其他營養(yǎng)物質(zhì)復(fù)配使用較為困難。蛋白質(zhì)改性是通過對(duì)蛋白質(zhì)的物化性質(zhì)進(jìn)行改善修飾，從而達(dá)到改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的目的[3]。當(dāng)前，蛋白質(zhì)改性研究主要集中在化學(xué)改性方面，如糖基化、酰化、脫酰胺、磷酸化、共價(jià)交聯(lián)等[4]。其中，糖基化改性僅通過加熱不需要催化劑即能自發(fā)進(jìn)行，是蛋白質(zhì)改性的理想方式之一[5]。蛋白質(zhì)的糖基化實(shí)質(zhì)就是蛋白質(zhì)分子與糖分子通過Maillard反應(yīng)共價(jià)結(jié)合[5]，從而使蛋白質(zhì)的起泡性[6]、溶解性[7]、乳化性[8]、凝膠性[9]和抗氧化性等顯著增強(qiáng)[10]，在食品工業(yè)中有較好的應(yīng)用前景。

目前，花生蛋白糖基化改性主要是研究還原糖的種類和糖鏈的長度[11]影響，未見低聚異麥芽糖的改性花生蛋白，并且超聲輔助處理方式的研究相對(duì)較少。超聲輔助有利于蛋白質(zhì)自由氨基暴露[12]，使低聚異麥芽糖易于改性花生蛋白，提高接枝改性程度，改善花生蛋白的功能性質(zhì)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。所以本研究探討超聲輔助處理對(duì)花生蛋白-低聚異麥芽糖的接枝改性的影響，并通過結(jié)構(gòu)分析接枝改性和超聲輔助效果，為花生蛋白改性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

花生粕(熱榨)由湖北魯花花生油公司提供；低聚異麥芽糖由上海源葉生物科技有限公司提供。

賴氨酸，Biosharp公司；鄰苯二甲醛(OPA)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV1750紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Nexus 470紅外光譜儀，美國梅特勤公司；J-1500圓二色譜儀，日本JASCO；F-4600熒光光譜儀，日本日立公司；KQ 2200DB 型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生粕的預(yù)處理

稱取60 g經(jīng)粉碎過80目篩的花生粕粉末置于索氏提取器中，加入適量的石油醚(60～90℃)，在70℃水浴8 h以達(dá)到脫脂的目的，晾干備用。

1.2.2 花生蛋白(PPI)的提取

采用堿溶酸沉的方法提取花生蛋白[11]，通過凱氏定氮法測得其蛋白質(zhì)含量為79.35%。

1.2.3 超聲輔助花生蛋白-低聚異麥芽糖接枝改性

參考Diftis等[13]的方法，稍作改動(dòng)。稱取適量的花生蛋白和低聚異麥芽糖按一定質(zhì)量比混合均勻后溶解于磷酸鹽緩沖液中定容，得到蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。將該溶液在pH 9.0條件下超聲處理后用冷水迅速冷卻，得到糖基化改性與超聲輔助改性結(jié)合的花生蛋白接枝物(U-PPI-IMO)。

1.2.4 樣品的制備

傳統(tǒng)加熱改性的花生蛋白(M-PPI)：反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間90 min，pH 9.0，反應(yīng)后的溶液于超濾管中離心得到懸濁液，冷凍干燥獲得固體樣品。

糖基化改性與傳統(tǒng)加熱改性結(jié)合得到的花生蛋白復(fù)合物(M-PPI-IMO)：花生蛋白與低聚異麥芽糖的質(zhì)量比1∶3，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間90 min，pH 9.0，反應(yīng)后的溶液于超濾管中離心得到懸濁液，冷凍干燥獲得固體樣品。

超聲輔助改性的花生蛋白(U-PPI)：超聲溫度70℃，超聲時(shí)間90 min，pH 9.0，超聲功率160 W，反應(yīng)后的溶液于超濾管中離心得到懸濁液，冷凍干燥獲得固體樣品。

糖基化改性與超聲輔助改性結(jié)合得到的花生蛋白復(fù)合物(U-PPI-IMO)：花生蛋白與低聚異麥芽糖的質(zhì)量比1∶3，超聲溫度70℃，超聲時(shí)間90 min，超聲功率160 W，pH 9.0，反應(yīng)后的溶液于超濾管中離心得到懸濁液，冷凍干燥獲得固體樣品。

1.2.5 接枝度的測定

鄰苯二甲醛(OPA)試劑配制：將40 mg OPA溶于1 mL甲醇后與25 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液(pH 9.5)，2.5 mL 20%SDS溶液和100 μLβ-巰基乙醇混合，用去離子水定容至50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配[14]。

測定方法：將4 mL OPA試劑加入到300 μL樣品溶液中，35℃下反應(yīng)2 min后用紫外分光光度計(jì)在340 nm處測定吸光度(y)，以賴氨酸(質(zhì)量濃度x)為標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的自由氨基含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.618x+0.033 4，R2=0.999 7。利用以下公式計(jì)算接枝度：

式中：C0為未反應(yīng)時(shí)自由氨基的含量；Ct為反應(yīng)時(shí)間t時(shí)自由氨基的含量。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品與溴化鉀以 1∶100 混合，研成粉末壓成薄片后，用傅里葉紅外光譜作全波段(4 000～400 cm-1)掃描32次，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 遠(yuǎn)紫外圓二色譜分析

將樣品用0.01 mol/L、pH 7.0磷酸鉀鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，室溫下在190～250 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行圓二色譜掃描，掃描速率為 100 nm/min，磷酸鉀鹽緩沖液作為空白對(duì)照。測定蛋白質(zhì)的平均橢圓度，進(jìn)而計(jì)算出蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.8 內(nèi)源熒光光譜分析

將樣品用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為0.1～0.2 mg/mL的溶液，在固定激發(fā)波長280 nm、掃描速度1 200 nm/min、發(fā)射波長范圍300～400 nm、狹縫寬度5 nm、掃描電壓700 V條件下測定其熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 花生蛋白與低聚異麥芽糖的質(zhì)量比對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

在超聲溫度60℃、超聲時(shí)間60 min、超聲功率100 W、pH 9.0條件下，研究花生蛋白與低聚異麥芽糖的質(zhì)量比(簡稱質(zhì)量比)對(duì)花生蛋白超聲輔助糖基化改性的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 花生蛋白與低聚異麥芽糖的質(zhì)量比對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

由圖1可知，隨著質(zhì)量比的增加，花生蛋白的接枝度呈現(xiàn)先上升后基本持平的趨勢。這可能是在質(zhì)量比1∶1到1∶3的過程中花生蛋白和低聚異麥芽糖充分結(jié)合，接枝度增加；質(zhì)量比1∶3之后隨著糖分子的增加，溶液濃度增大，分子間的碰撞概率減少，所以接枝度變化很小。因此，選擇花生蛋白與低聚異麥芽糖的質(zhì)量比為1∶3較合適。

2.1.2 超聲功率對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

在質(zhì)量比1∶3、超聲溫度60℃、超聲時(shí)間60 min、pH 9.0條件下，研究超聲功率對(duì)花生蛋白超聲輔助糖基化改性的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著超聲功率的增加，花生蛋白的接枝度呈現(xiàn)先增加后基本持平的趨勢。其原因可能是由于隨著超聲功率的增加，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)以及機(jī)械剪切作用也在增大，蛋白質(zhì)分子發(fā)生了機(jī)械性振蕩，破壞了蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，使維持原來有序螺旋結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵斷開，肽鏈展開，分子結(jié)構(gòu)變得疏松，內(nèi)部自由氨基暴露，花生蛋白的接枝度增加；此外，還可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚泶驍嗔说鞍踪|(zhì)分子表面的自由氨基群與鄰近的羧基群之間的靜電引力[15]，使蛋白質(zhì)分子彼此分散，不易聚集。因此，選擇超聲功率160 W較為合適。

圖2 超聲功率對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

2.1.3 超聲溫度對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

在質(zhì)量比1∶3、超聲功率160 W、超聲時(shí)間60 min、pH 9.0條件下，研究超聲溫度對(duì)花生蛋白超聲輔助糖基化改性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲溫度對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

由圖3可知，隨著超聲溫度的升高，花生蛋白的接枝度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這可能是因?yàn)殡S著超聲溫度的升高，花生蛋白的溶解度增大，自由氨基濃度也隨之增大，同時(shí)適當(dāng)?shù)母邷乩陔逆溦归_，內(nèi)部自由氨基暴露，花生蛋白與糖分子碰撞次數(shù)增加，有利于糖基化反應(yīng)。但是，在過高的溫度下蛋白質(zhì)聚集或變性，所以自由氨基的含量又降低。因此，選擇超聲溫度65℃較為合適。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

在質(zhì)量比1∶3、超聲功率160 W、超聲溫度65℃、pH 9.0條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)花生蛋白超聲輔助糖基化改性的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長，花生蛋白的接枝度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長，超聲波產(chǎn)生的空化、機(jī)械剪切和熱作用使得花生蛋白中維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵破壞，肽鏈變得疏松，同水分子結(jié)合能力增強(qiáng)，花生蛋白的溶解度增加，利于糖基化反應(yīng)的發(fā)生。在90 min后，隨著超聲時(shí)間的延長，花生蛋白的疏水性基團(tuán)增多，花生蛋白重新聚集，所以花生蛋白經(jīng)歷了先解離后聚合的過程。因此，在超聲時(shí)間90 min時(shí)，花生蛋白的接枝度達(dá)到最大。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)花生蛋白糖基化改性的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken 原理，以超聲功率(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)為因素，花生蛋白的接枝度(Y)為響應(yīng)值，在質(zhì)量比1∶3、pH 9.0條件下進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，其中因素水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到了關(guān)于花生蛋白-低聚異麥芽糖接枝度對(duì)各影響因子的二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=20.83+1.00A+0.96B-0.14C-0.25AB-0.88AC+1.29BC-2.34A2-3.72B2-0.93C2。

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

注：**表示相關(guān)性極顯著P<0.01；*表示相關(guān)性顯著P<0.05。

由表3可知，該回歸模型的P=0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2為0.969 9，說明該回歸模型擬合成功，擬合度達(dá)96.99%，效果極顯著；該回歸模型的失擬項(xiàng)P=0.739 7>0.05不顯著，該擬合方程可靠，可用來預(yù)測超聲輔助花生蛋白-低聚異麥芽糖糖基化改性的接枝度。

經(jīng)過對(duì)超聲輔助花生蛋白-低聚異麥芽糖接枝改性的條件進(jìn)行優(yōu)化，其最優(yōu)參數(shù)為超聲功率164.4 W、超聲溫度69℃、超聲時(shí)間90.89 min，此時(shí)花生蛋白的接枝度為20.93%。為驗(yàn)證該回歸模型的可靠性，確定試驗(yàn)條件為超聲功率160 W、超聲溫度70℃、超聲時(shí)間90 min，此條件下花生蛋白的接枝度為21.30%。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

花生蛋白(PPI)及其接枝物(PPI-IMO)的紅外光譜圖如圖5所示。

注：a.M-PPI;b.U-PPI;c.M-PPI-IMO;d.U-PPI-IMO。下同。

圖5花生蛋白及其接枝物的傅里葉變換紅外光譜圖

2.4 遠(yuǎn)紫外圓二色譜分析

利用圓二色譜測定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圓二色譜測定的花生蛋白及其接枝物在溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖6所示。

圖6 花生蛋白及其接枝物的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖

由圖6可知，接枝物的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，最大負(fù)吸收峰減弱，并且負(fù)峰的吸收波長位置向長波長方向偏移。根據(jù)圖6計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)分子各種結(jié)構(gòu)所占的比例?；ㄉ鞍准捌浣又ξ锏摩?螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲的相對(duì)含量如表4所示。

表4 花生蛋白及其接枝物的二級(jí)結(jié)構(gòu)及相對(duì)含量 %

由表4可知，接枝物的α-螺旋和β-折疊均有所減少，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加，尤其經(jīng)超聲作用的接枝物結(jié)構(gòu)變化更大，比M-PPI-IMO更為松散。這說明在超聲作用下，蛋白質(zhì)分子展開，更多的自由氨基暴露，低聚異麥芽糖與之共價(jià)結(jié)合，花生蛋白從有序向無序的狀態(tài)轉(zhuǎn)變，更加明顯地修飾了接枝物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由以上分析可知，超聲輔助糖基化更能改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高接枝度。

2.5 內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是由芳香族氨基酸殘基形成的，并且極性環(huán)境會(huì)影響生色團(tuán)基團(tuán)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能級(jí)，減少激發(fā)態(tài)的能量，引起發(fā)射譜的紅移?；ㄉ鞍准捌浣又ξ锏膬?nèi)源熒光光譜如圖7所示。

圖7 花生蛋白及其接枝物的內(nèi)源熒光光譜

由圖7可知，接枝物與花生蛋白相比，均發(fā)生了不同程度的藍(lán)移，特別是U-PPI-IMO的藍(lán)移程度較大。一方面可能是花生蛋白在超聲作用下，花生蛋白的肽鏈伸展程度強(qiáng)于M-PPI，使芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團(tuán)從非極性環(huán)境逐漸暴露于極性水溶液中，蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的λmax逐漸增大，蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度也增大，結(jié)構(gòu)更加松散；另一方面可能是花生蛋白與低聚異麥芽糖接枝較高，大量的羥基遮蔽了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的芳香族氨基酸，同時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部重新折疊，使得色氨酸所處的非極性更強(qiáng)。綜上所述可知，超聲輔助糖基化使得花生蛋白的芳香族氨基酸所處的微環(huán)境的非極性強(qiáng)于M-PPI-IMO，結(jié)構(gòu)也更為松散。

3 結(jié) 論

在超聲輔助條件下，花生蛋白和低聚異麥芽糖發(fā)生了糖基化反應(yīng)，花生蛋白接枝改性成功，其最佳改性條件為花生蛋白與低聚異麥芽糖的質(zhì)量比 1∶3、超聲功率160 W、超聲溫度70℃、超聲時(shí)間90 min、pH 9.0，此條件下花生蛋白的接枝度為21.30%。通過觀察花生蛋白及其接枝物的紅外光譜、圓二色譜、熒光光譜，可知花生蛋白與低聚異麥芽糖發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，并且與傳統(tǒng)熱處理方式相比，超聲作用更容易使花生蛋白的結(jié)構(gòu)從有序向無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變，自由氨基暴露，從而接枝度較高。

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