李寶善 鐘 淼 蔣 宜 唐渝平 裴文楠 李婷婷

(重慶市急救醫(yī)療中心老年科，重慶 400014)

Klotho基因是1997年由Kuro及其同事首次在小鼠中發(fā)現(xiàn)的一種抑制衰老相關(guān)表型的基因，并以古希臘神活中紡織生命之線女神的名字——Klotho來(lái)命名。研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因突變與人類衰老的各種表型，包括壽命縮短、動(dòng)脈硬化、肺氣腫、骨質(zhì)疏松(OP)等有密切關(guān)系〔1〕。早期研究發(fā)現(xiàn)Klotho 缺陷小鼠股骨、脛骨及椎骨骨皮質(zhì)厚度較野生型小鼠顯著減低，其骨代謝主要特點(diǎn)為：骨形成與骨吸收明顯減低，骨形成減低程度超過(guò)骨吸收，其結(jié)果導(dǎo)致凈骨量丟失，呈低骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，即類似于人類老年OP的骨代謝特征〔2〕。隨后研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Klotho缺陷(突變)小鼠的成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，其成骨細(xì)胞增殖正常而其堿性磷酸酶活性減低、礦化的基質(zhì)形成顯著減少；而破骨細(xì)胞的吸收活性與成活率均正常，但其破骨細(xì)胞前體分化為破骨細(xì)胞過(guò)程則明顯受到抑制〔3〕，即提示Klotho缺陷影響了小鼠骨代謝過(guò)程。Yamada等〔4〕、Zarrabeitia等〔5〕在研究不同人群Klotho基因單核苷酸多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Klotho基因啟動(dòng)區(qū) G-395A單核苷酸多態(tài)性與其骨密度有明確相關(guān)性。田小春等〔6〕在研究Klotho基因 G-395A 、F352V 與C370S單核苷酸多態(tài)性與老年人群原發(fā)性O(shè)P關(guān)系時(shí)，也發(fā)現(xiàn)Klotho基因 G-395A 單核苷酸多態(tài)性與漢族人群OP有明確相關(guān)性，且存在著性別差異性，這就說(shuō)明Klotho基因與人類OP有明確相關(guān)性。而針對(duì)Klotho基因表達(dá)產(chǎn)物——Klotho蛋白水平變化與老年OP相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究分析血漿Klotho、FGF23蛋白水平與老年OP的相關(guān)性及可能信號(hào)通路。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 2013 年5月至2015年5月重慶市急救醫(yī)療中心住院老年OP患者 92例為研究組，男 28 例，女64例，年齡60～99歲，均采用雙能X線檢查法測(cè)定骨密度(BMD)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)1994 年推薦的OP標(biāo)準(zhǔn)診斷。均未服用性激素、糖皮質(zhì)激素或任何影響鈣磷代謝的藥物，排除患有甲狀腺疾病、Cushing 綜合征、嚴(yán)重全身慢性疾病。對(duì)照組為同期住院病人經(jīng)雙能X線檢查排除OP老年患者92例，男49例，女43例，年齡60～93歲。兩組性別、年齡無(wú)顯著差異。本研究方案通過(guò)重慶市急救醫(yī)療中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，均簽署知情同意書。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 血脂異常診斷符合《中國(guó)成人血脂異常防治指南》(2007)〔7〕；高血壓診斷參考《中國(guó)高血壓防治指南2010》〔8〕；2型糖尿病診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3BMD及生化指標(biāo)測(cè)定 應(yīng)用雙能X線骨密度儀(美國(guó)GE 公司)，檢測(cè)部位為第2、3腰椎(L2～L3)，股骨頸和股骨大粗隆，如，有1個(gè)或以上部位T值(所測(cè)BMD與正常同性別、同部位峰值骨量的差)≤-2.5s診斷為OP。測(cè)定結(jié)果由美國(guó)GE 公司配置的軟件進(jìn)行分析?；颊呷朐捍稳涨宄繙y(cè)量身高、體重，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)。抽取空腹靜脈血6 ml，其中3 ml肝素抗凝，湘儀L400臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(中國(guó)湖南湘儀離心機(jī)廠生產(chǎn))2 500 r/min離心10 min分離血漿，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫挥? ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 500 r/min離心10 min分離血清，使用日立7060全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖。取血漿樣品100 μl，應(yīng)用人Klotho、FGF23蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒(DY5334-05、DY2604-05、DY008，購(gòu)自美國(guó)R&D公司)，使用SpectraMax M2e 酶標(biāo)儀，按試劑盒說(shuō)明書流程操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用PASW18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和Logistic 多因素回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般臨床情況對(duì)比 研究組女性患者比例明顯高于對(duì)照組，同時(shí)血漿Klotho蛋白、FGF23蛋白水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。而兩組年齡、BMI、血脂異常、高血壓和糖尿病患者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般臨床情況對(duì)比

2.2低血漿Klotho蛋白水平是老年OP獨(dú)立危險(xiǎn)因素 以中位數(shù)為分界線，低于中位數(shù)視為血漿Klotho、FGF23降低，賦值為1，否則賦值為0；患有血脂異常、高血壓、糖尿病者賦值為1，否則賦值為0。Logistic多因素回歸分析提示血漿Klotho蛋白水平、女性是老年OP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

表2 OP危險(xiǎn)因素的多因素回歸分析

3 討 論

OP是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。OP分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性O(shè)P又分為絕經(jīng)后OP(Ⅰ型)、老年性O(shè)P(Ⅱ型)和特發(fā)性O(shè)P(包括青少年型)3種。而臨床中最多見(jiàn)的是絕經(jīng)后OP及老年性O(shè)P。OP導(dǎo)致的髖骨、橈骨遠(yuǎn)端及脊柱壓縮性骨折發(fā)生率也明顯增加，而老年OP所致骨折常出現(xiàn)延遲愈合或不愈合，因而嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量、導(dǎo)致社會(huì)家庭負(fù)擔(dān)增加。OP發(fā)病過(guò)程中不僅受到來(lái)自其自身內(nèi)環(huán)境與生活外環(huán)境的影響，也受到其本身遺傳基因及其表達(dá)狀態(tài)的調(diào)控。前期研究〔9〕中應(yīng)用攜帶小鼠Klotho基因的腺相關(guān)病毒載體作用于去勢(shì)制備的OP(類似于絕經(jīng)后OP)模型大鼠，發(fā)現(xiàn)Klotho表達(dá)上調(diào)明顯減緩OP病情進(jìn)展和改善OP骨微結(jié)構(gòu)的破壞程度。推測(cè)Klotho在原發(fā)性O(shè)P發(fā)生、發(fā)展中所起的作用有可能就是通過(guò)Klotho蛋白的生物活性來(lái)影響骨代謝而發(fā)揮其生物學(xué)作用的。膜型Klotho蛋白作為FGF23的一種特有的受體輔助因子，通過(guò)形成Klotho-FGF23-FGF受體1復(fù)合物形式影響FGF23的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮其調(diào)節(jié)血磷、維生素D3穩(wěn)態(tài)及骨礦化等作用〔10〕。學(xué)者〔11〕也發(fā)現(xiàn)在合并有2型糖尿病的OP患者中，血清FGF23明顯下降，提示FGF23與OP有關(guān)。由此推測(cè)Klotho蛋白可能就是通過(guò)FGF23通路調(diào)節(jié)骨代謝，影響OP的發(fā)生、發(fā)展。而其具體信號(hào)通路、調(diào)節(jié)機(jī)制還有待究。

本研究也證實(shí)了老年女性是OP高發(fā)人群，及時(shí)、有效干預(yù)女性高危人群極其重要。本研究提示低FGF23水平并非OP獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果一致〔12〕。

1Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕.Nature，1997；390(6655)：45-51.

2Kawaguchi H，Manabe N，Miyaura C，etal.Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia〔J〕.J Clin Invest，1999；104(3)：229-37.

3Kawaguchi H，Manabe N，Chikuda H，etal.Cellular and molecular mechanism of low-turnover osteopenia in the klotho-deficient mouse〔J〕.Cell Mol Life Sci，2000；57(5)：731-7.

4Yamada Y，Ando F，Niino N，etal.Association of polymorphisms of the androgen receptor and klotho genes with bone mineral density in Japanese women〔J〕.J Mol Med，2005；83(1)：50-7.

5Zarrabeitia MT，Hernández JL，Valero C，etal.Klotho gene polymorphism and male bone mass〔J〕.Calcif Tissue Int，2007；80(1)：10-4.

6田小春，馬厚勛，劉曉林，等.重慶老年漢族人群klotho G-395A、F352V與C370S基因多態(tài)性與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010；35(12)：1769-72.

7中國(guó)成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會(huì).中國(guó)成人血脂異常防治指南〔J〕.中華心血管病雜志，2007；35(5)：390-419.

8中國(guó)高血壓防治指南修訂委員會(huì).中國(guó)高血壓防治指南2010〔J〕.中華心血管病雜志，2011;39(7)：579-616.

9王艷嬌，馬厚勛，李寶善，等.腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的klotho基因表達(dá)對(duì)去勢(shì)大鼠骨Runx2及MMP-13表達(dá)的影響〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012；32(5)：487-92.

10Yamazaki M，Ozono K，Okada T，etal.Both FGF23 and extracellular phosphate activate Raf/ MEK/ERK pathway via FGF receptors in HEK293 cells〔J〕.J Cell Biochem，2010；111(5)：1210-21.

11Reyes-Garcia R，Garcia-Martín A，García-Fontana B，etal.FGF23 in type 2 diabetic patients：relationship with bone metabolism and vascular disease〔J〕.Diabetes Care，2014；37(5)：e89-90.

12Desjardins L，Liabeuf S，Renard C，etal.FGF23 is independently associated with vascular calcification but not bone mineral density in patients at various CKD stages〔J〕.Osteopor Int，2012；23(7)：2017-25.