毛可適 王正閣 任艷玲 蔣 穎 劉 猛

(蘇州大學附屬第三醫(yī)院 常州市第一人民醫(yī)院神經內科，江蘇 常州 213000)

動脈粥樣硬化(AS)是一個長期的免疫炎性反應過程，免疫調節(jié)性T細胞在其發(fā)生發(fā)展進程中扮演重要角色〔1，2〕。CD4+CD25+Treg細胞是一種新型免疫調節(jié)性T細胞，具有一定抗AS的作用，但目前尚無其在腦梗死急性期動態(tài)變化及與AS程度相關性的研究〔3〕。本研究旨在分析CD4+CD25+Treg細胞比例的動態(tài)演變過程及其與AS程度的相關性。

1 資料和方法

1.1研究對象 經常州市醫(yī)學倫理委員會同意，選取常州市第一人民醫(yī)院2014年1月至2016年1月收治的老年AS性腦梗死患者48例作為觀察組。納入標準：(1)年齡≥65歲且<80歲，男女不限；(2)符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的急性腦梗死的診斷標準，經病史和影像學檢查證實〔4〕；(3)頸部血管彩超檢測頸動脈內-中膜厚度(IMT)>1.0 mm；(4)于發(fā)病當天入院。排除標準：(1)近3個月內發(fā)生急性心腦血管疾病者；(2)近3個月服用過非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑、類固醇等可影響外周血CD4+CD25+Treg細胞水平的藥物；(3)近1個月內發(fā)生感染性疾病者；(4)合并糖尿病、代謝性疾病和重要器官功能不全者；(5)合并神經精神類疾病者。將觀察組根據頸動脈硬化程度〔5〕分為輕度組(1.0 mm0.05)，具有可比性。見表1。所有研究對象對本次研究知情并簽署同意書。

1.2實驗試劑及儀器 (1)異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人IgG和CD25抗體，PE標記的鼠抗人CD4抗體(美國Beckman Coulter公司)；(2)磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京利得曼生物科技有限公司)；(3)DT5-2型離心機(北京時代北利離心機有限公司)；(4)Epics XL型流式細胞儀、流式試管及配套設備(上海珂淮儀器有限公司)；(5)飛利浦CX50彩色多普勒超聲診斷儀(上海創(chuàng)訊醫(yī)療器械有限公司)。

表1 各組一般資料對比

1.3方法

1.3.1CD4+CD25+Treg細胞比例檢測 采取研究對象清晨空腹靜脈血2 ml于抗凝真空管中，置于-80℃冰箱中保存待測。取2支FCM試管，各加入150 μl抗凝血，避免槍頭觸碰管底及管壁，動作迅速，不要將血掛在管壁上，操作完畢后振蕩混勻，分別標記為對照管和染色管。于對照管中滴加IgG-FITC和CD4-PE各10 μl，染色管中滴加CD25-FITC和CD4-PE各10 μl，振蕩搖勻后避光室溫條件下放置20 min。然后在2支試管中滴加紅細胞裂解液400 μl和PBS液400 μl，振蕩搖勻后避光5℃放置20 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清液后再次滴加PBS液500 μl重懸制備單細胞懸液。將單細胞懸液置于流式細胞儀中檢測，每個樣品檢測30 000個以上細胞，通過軟件分析并計算CD4+CD25+Treg細胞百分比。

1.3.2IMT測量 采用配置7.0～10.5 MHz線陣探頭的飛利浦CX50彩色多普勒超聲診斷儀對受試者雙側頸動脈進行檢查：患者平臥位，頭稍后仰，充分暴露檢查部位，將探頭置于頸前，自頸動脈起始處掃描，多平面、多角度依次檢查頸總動脈、頸總動脈分叉處及頸內動脈。注意觀察血管管壁、管徑和斑塊情況。在縱向探查血管壁時可見較亮的兩條平行線，兩線間垂直距離為IMT，以雙側頸總動脈遠端近分叉處1 cm、分叉處和頸內動脈起始處上方1 cm共3個部位的IMT平均值作為結果〔6〕。

1.4觀察指標 (1)發(fā)病后1～7 d觀察組、對照組及各亞組CD4+CD25+Treg細胞百分比；(2)觀察組IMT與CD4+CD25+Treg細胞百分比的相關性。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件，計量資料多組間比較采用方差分析，兩兩比較應用t檢驗，計數資料應用χ2檢驗。

2 結 果

2.1觀察組腦梗死后不同時間外周血CD4+CD25+Treg細胞水平變化 腦梗死后第1天和第2天觀察組CD4+CD25+Treg細胞百分比均低于對照組，第5～7天高于對照組(P<0.05)，其余2 d差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2腦梗死各亞組發(fā)病不同時間外周血CD4+CD25+Treg細胞水平變化 腦梗死后第1～7天，三亞組間CD4+CD25+Treg細胞百分比比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 觀察組發(fā)病后1～7 d外周血CD4+CD25+Treg細胞水平變化

表3 腦梗死各亞組發(fā)病不同時間外周血CD4+CD25+Treg細胞水平變化

與輕度組比較:1)P<0.05；與中度組比較:2)P<0.05

2.3外周血CD4+CD25+Treg細胞水平與IMT的相關性 外周血CD4+CD25+Treg細胞水平與頸動脈IMT值具有一定相關性，以發(fā)病后第4天為例，觀察組CD4+CD25+Treg細胞百分比與頸動脈IMT值呈明顯負相關(r=-0.543,P<0.05)。見圖1。

圖1 腦梗死患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平與頸動脈IMT值的相關性

3 討 論

急性腦梗死的病理基礎為AS斑塊破裂和血栓形成，免疫反應和炎性反應伴隨在整個發(fā)生發(fā)展過程中，對其損傷機制的深入研究可為診斷和治療AS性腦梗死提供重要指導意義〔7，8〕。CD4+CD25+Treg細胞是一種由Th1細胞分化而來的免疫調控細胞，可通過分泌炎性因子調控促炎/抗炎平衡，研究機體CD4+CD25+Treg細胞比例可為監(jiān)測患者病情動態(tài)變化、制定針對免疫功能的治療方案提供新思路〔9〕。

從本次研究的結果來看，急性腦梗死后CD4+CD25+Treg水平是一個先下降后升高的過程。結合Knoflach等〔10〕的研究，分析可能與局部炎癥反應同全身免疫反應間平衡有關，腦梗死后早期炎癥反應以局部促炎反應為主，輔助性T(Th)細胞、樹突細胞和單核巨噬細胞等致病性細胞，腫瘤壞死因子(TNF)-α、趨化性細胞因子等炎性介質大量表達，通過破損的血腦屏障進入炎性區(qū)域與固有炎性反應共同發(fā)揮作用，因此CD4+CD25+Treg細胞百分比低于對照組。隨著時間推移，上述細胞及細胞因子刺激機體分化CD4+CD25+Treg細胞，目的在于表達Foxp3、轉化生長因子(TGF)-β和白細胞介素(IL)-10等細胞因子，從而抑制促炎因子表達，通過調節(jié)免疫平衡減輕梗死部位腦組織的免疫損傷，因此CD4+CD25+Treg細胞百分比高于對照組〔11〕。本研究與胡月華等〔12〕的結果一致，說明CD4+CD25+Treg細胞百分比可作為評估AS程度的一個客觀指標，其機制可能與以下兩點有關：(1)生成減少，AS往往伴隨低密度脂蛋白(LDL)的生成和血管內皮細胞的破壞，在單核細胞浸潤的環(huán)境下，CD4+T細胞更易分化為Th1細胞，旨在通過分泌TNF-β、IL-2和IL-4等致炎因子，導致CD4+CD25+Treg細胞的比例下降；此外，機體異常激活狀態(tài)也可直接抑制CD4+T細胞向CD4+CD25+Treg細胞分化。(2)自身凋亡，AS的進展也是氧化應激的過程，氧化應激狀態(tài)可直接促進細胞凋亡，與其他CD4+T細胞相比，CD4+CD25+Treg細胞對氧化應激具有更高的敏感性，因此比例大大降低。綜上，老年AS性腦梗死患者急性期外周血CD4+CD25+Treg細胞百分比可作為評估腦缺血及血管內皮功能的非侵入性指標，對指導治療具有重要意義。

1馮 靜，費 瑜，孟曉萍.CD4+和CD8+T淋巴細胞與動脈粥樣硬化相關性研究進展〔J〕.中國動脈硬化雜志，2011;19(8)：707-10.

2張津華，馬麗麗，李江坤，等.不同TOAST分型腦梗死患者外周血T淋巴細胞亞群的分布特點〔J〕.廣東醫(yī)學，2014;35(20)：3178-80.

3劉曉陽，康春陽，韓瑩瑩，等.急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Treg)水平的變化及臨床意義〔J〕.中國實驗診斷學，2013;17(9)：1621-4.

4Mandavia R,Qureshi MI,Dharmarajah B,etal.Safety of carotid intervention following thrombolysis in acute ischaemic stroke〔J〕.Eur J Vasc Endovasc Surg,2014;48(5):505-12.

5金夕雅，王立波，趙云華，等.急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Treg)的動態(tài)變化研究〔J〕.中國實驗診斷學，2013;17(8)：1423-5.

6王潤芳，梁紅萍.急性腦梗死患者T淋巴細胞亞群的變化及意義〔J〕.山西中醫(yī)學院學報，2013;14(5)：73-4.

7蔣福生，張 平，張新華.急性腦梗死患者免疫調節(jié)性T淋巴細胞表達與預后的關系〔J〕.中國動脈硬化雜志，2013;21(10)：923-6.

8聶大奧，陳俊拋，邢一蘭.急性腦梗死患者外周血CD4CD25T細胞和CD4CD28-T細胞的變化〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2014;16(3)：230-2.

9張 倩，孫 薇，楊建波，等.頸動脈粥樣硬化性急性腦梗死患者輔助性T細胞17和調節(jié)性T細胞的表達水平及意義〔J〕.臨床薈萃，2015;30(6)：682-3.

10Knoflach M,Matosevic B,Rucker M,etal.Functional recovery after ischemic stroke—A matter of age〔J〕.Neurology,2012;78(4):279-85.

11Xie P,Su Y,Tang H,etal.The effect of CD4+CD25+regulatory T cells on the proliferation,migration and adhesion of endothelial progenitor cells〔J〕.J Clin Cardiol(China),2011;27(1):63-6.

12胡月華，鄭燕華，唐 雋，等.顱內動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4+CD25+FOXP3+調節(jié)性T細胞檢測及意義〔J〕.免疫學雜志，2011;27(5)：420-3.